介紹
煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是一種普遍存在的分子，透過與NADH的相互轉化接受和給予電子，在細胞代謝中起著關鍵作用。NAD在糖酵解的GAPDH依賴性步驟中是必需的，並且提供電子傳遞鏈的複合物I的還原當量來驅動氧化磷酸化。NAD還作為多種參與細胞彈性的酶的基本共基質，包括sirtuins和聚（ADP核糖）聚合酶（3）。在失血性休克期間，NAD的組織濃度迅速下降，與損傷的嚴重程度成比例（4）。NAD的可利用性降低因NADH的氧化還原轉變而進一步加劇，在缺氧條件下，NADH不再透過線粒體電子傳遞鏈有效地再氧化為NAD（5）。在其他情況下，NAD缺失會導致線粒體功能障礙和細胞死亡（6，7），增強NAD可以改善組織功能（8–10）。考慮到NAD在細胞能量代謝、訊號傳導和一系列其他生化反應中的中心作用，恢復NAD的復甦策略在失血性休克的治療上是有用的。
NAD可以從飲食中的色氨酸、煙酸（煙酸）或合成途徑中的中間產物從頭合成，但大多數細胞NAD來自釋放的煙醯胺的迴圈。煙醯胺在煙醯胺磷酸核糖基轉移酶（NAMPT）催化的限速步驟中轉化為煙醯胺單核苷酸（NMN）。然後NMN被3種NMN腺苷酸轉移酶亞型（NMNAT1–3）中的1種轉化為NAD（11）。Chaudry及其同事在1976年首次描述了失血性休克復甦期間使用NAD前體的情況（12）。儘管輸注NAD、煙醯胺和煙酸都增加了肝和腎組織中NAD的濃度，但治療並不能恢復組織ATP水平，也不能提高存活率。因此，這些研究者的結論是“這些輸液沒有有益的效果”，而研究失血性休克期間NAD代謝影響的研究在隨後的幾十年中仍然相對停滯。然而，Chaudry開創性實驗中的最小復甦方案可能限制了潛在的益處。最近，大劑量口服煙酸（1080 mg/kg）已被證明可改善失血性休克後的肺損傷（13）。復甦時給予煙酸，可使肺NAD濃度恢復到基線值，減輕炎症，並將均勻致死模型轉化為存活率為30%的模型。因此，NMN等NAD前體的使用值得進一步研究。
儘管補充NMN的益處尚未在創傷中被研究過，但是有越來越多的文獻表明NMN可以證明在治療上是有用的。提供外源性NMN可繞過補救途徑中NAMPT的需要，並已被證明可快速增加組織NAD（14）。這一點尤其重要，因為在缺血/再灌注的情況下NAMPT可能受到抑制，而NAMPT活性的降低可能導致失血性休克中NAD的降低（15）。此外，NAMPT催化的反應在能量上是昂貴的，因此，當細胞受到能量脅迫時，直接提供其產物可能特別有用（16）。重要的是，有證據表明NMN可以急性減輕缺血/再灌注損傷的影響。在小鼠心肌梗死模型中，缺血前30分鐘用NMN預處理顯著增加了NAD的基礎水平，阻止了缺血後NAD損傷的下降，縮小了梗死麵積（17）。因此，使用NMN作為復甦輔助物來支援新陳代謝可以提高細胞的彈性。
本研究探討外源性NMN對失血性休克的代謝和線粒體的影響。我們的研究結果提示NMN能維持氧化磷酸化，增強生理儲備，提高嚴重休克後的存活率。
結果
固定壓力失血性休克預處理及NMN復甦減少乳酸酸中毒。 為了研究NMN在失血性休克和復甦過程中的生理作用，我們對NMN預處理的大鼠（400 mg/kg/d，5天，口服）和對照組進行固定壓力休克，然後進行復蘇（400 mg/kg，靜脈注射）（圖1A）。NMN劑量與體重成正比，復甦量為失血性休克時出血量的4倍。NMN和對照組動物的平均動脈血壓（MAP）保持在40 mmHg，持續90分鐘。兩組的血容量下降率相似，迴圈血紅蛋白下降率相似（圖1，B和E）。雖然兩組之間維持休克狀態90分鐘所需的液體量和復甦後的血壓在統計學上不可區分，但接受NMN治療的大鼠接受的總體液體量略少，表明他們沒有比對照組更徹底地復甦（圖1，C–E）。重要的是，儘管經歷了相同程度和持續時間的失血，但在失血性休克和復甦期間，NMN治療的大鼠血清乳酸顯著低於對照組（圖1F）。作為無氧代謝的副產品，乳酸被用來衡量人類復甦的成功與否（18）。乳酸水平升高反映了持續的組織灌注不足，與受傷患者休克的嚴重程度和存活率相關（19）。即使乳酸的微小差異也能轉化為顯著的生存益處。事實上，創傷患者的初始乳酸每增加1毫米，死亡率就會增加15%（20%）。因此，在我們的模型中，NMN復甦後觀察到的乳酸減少2-3毫米可能與生理有關。
NMN增加NAD並儲存生物能。 失血性休克導致吡啶和腺嘌呤核苷酸庫顯著降低，這會對重要器官的功能產生負面影響（21）。我們檢測了外源性NMN是否能維持休克後腎和肝組織中NAD和ATP的水平。在假手術動物中，NMN顯著增加腎臟和肝臟的NAD水平（圖2，
圖1。實驗設計和生理變數。將動物隨機分為含或不含NMN的水（400 mg/kg/d）5天（每組n=9-12）。將動物放血至平均動脈血壓（MAP）為40 mmHg，持續90分鐘，然後在60分鐘（a）內，用4倍於乳酸林格氏液（含或不含NMN，400 mg/kg）的減排量進行復蘇。對照組動物與NMN治療組動物在總出血量百分比（B）、維持MAP為40 mmHg 90分鐘所需的LR體積（C）或復甦60分鐘後的MAP（D）方面沒有差異。組間血紅蛋白相似（E）。NMN治療的動物在休克期間和復甦後乳酸水平顯著降低（F）。B–D中的資料用方框和晶須圖表示，方框表示IQR，線條表示中值，晶須表示最小值和最大值，而E和F中的資料表示為平均值±SEM。*P
A和B，以及補充圖1；本文線上提供的補充材料；https：//doi。org/10。1172/jci。insight公司。120182DS1）。復甦後，NMN治療組動物的NAD水平比休克對照組動物高近3倍。失血性休克後，NMN處理的動物NADH也顯著升高。有趣的是，失血性休克引起的NAD下降（在沒有補充NMN的情況下）沒有以前的報道那麼顯著（12）。我們推測這種差異可能是繼發於動物復甦方式和組織採集時間的差異。在Chaudry最初的研究中，動物沒有用NAD前體進行預處理。此外，他們僅用流出的血液進行復蘇，30分鐘後採集樣本。現在人們認識到，這種策略使動物處於復甦狀態（22）。相反，我們用4倍於脫落體積的乳酸林格氏（LR）晶體復甦，1小時後收穫組織。當我們在未受刺激的動物中檢測失血性休克後的NAD時，我們觀察到
圖2。NMN增加NAD和NADH，並在失血性休克復甦後保護腎ATP。在失血性休克90分鐘後1小時採集的速凍組織提取液中測定NAD、NADH和ATP水平，然後用或不用NMN（400 mg/kg）復甦。在腎臟中，NMN增加了假手術組（n=5-6/治療組）和休克動物（9-12/治療組）的NAD和NADH水平，並阻止了休克動物中觀察到的NAD/NADH比率的急劇下降（A）。在肝臟中，NMN增加了假手術和休克動物的NAD水平，但僅顯著增加了休克動物的NADH，同時又保持了NAD/NADH比值（B）。失血性休克和復甦（C和D）後，兩種組織的ATP水平均下降。然而，NMN治療完全阻止了腎組織的這種下降（C）。如果有統計學意義（P
更大的下降（腎臟32%，肝臟51%，補充圖1），與Chaudry及其同事最初描述的下降一致（12）。因此，我們的結果表明復甦本身可以部分恢復NAD，但不能逆轉休克後NAD/NADH比值的強烈下降（圖2、A和B以及補充圖1）。重要的是，NMN完全緩解了NAD濃度的降低，並保持了兩種組織中NAD/NADH的氧化還原比率。
失血性休克和復甦也會耗盡ATP儲備，這可能是線粒體功能障礙的結果，導致對無氧代謝的依賴性增加。正如預期的那樣，腎和肝在休克和復甦後ATP水平顯著降低（圖2，C和D）。NMN治療實質上挽救了腎臟中的ATP水平，而肝臟儲存更為壓抑，不能用NMN挽救（圖2，C和D）。
NMN維持NAD依賴的線粒體呼吸。 考慮到腎臟ATP的恢復和乳酸積累的減少，我們想知道NMN處理是否能積極影響線粒體呼吸。我們發現，當脂肪酸或標準丙酮酸/穀氨酸/蘋果酸混合物作為底物時，失血性休克和復甦損害了兩種組織中的複合物I依賴性（CI依賴性）呼吸（圖3，a和B）。當電子透過琥珀酸直接供給配合物II（CII）或透過TMPD/抗壞血酸直接供給配合物IV時，沒有明顯的缺陷。由於CI接受來自NADH的電子，這些結果表明NAD池（參與NADH生成的上游因子）或CI本身存在缺陷。與NAD和隨後的NADH形成是限制因素的可能性一致，NMN治療完全保留了失血性休克後的CI依賴性呼吸（圖3，A和B）。
為了更直接地檢驗線粒體NAD缺失導致CI依賴性呼吸能力缺陷的假說，我們接下來試圖測定休克後分離線粒體中的NAD水平。據我們所知，線粒體NAD池與細胞核和細胞質池（23）分離，以前在失血性休克中沒有檢測過。雖然NMN顯著增加了腎臟和肝臟的線粒體NAD，但我們驚訝地發現失血性休克並沒有降低線粒體NAD。事實上，與全組織NAD相比，休克後對照組動物的腎臟（圖3C）中線粒體水平保持不變，肝臟中線粒體水平顯著增加（圖3D）。NMN處理進一步增加線粒體NAD濃度（圖3，C和D）。因此，線粒體NAD池的大小本身不能解釋線粒體呼吸的變化。NADH不能在分離的線粒體中重複檢測到，很可能是由於分離過程中氧化還原電位的崩潰。
有趣的是，失血性休克後線粒體對脂肪酸氧化的能力降低，這種作用被腎臟而非肝臟細胞器中的NMN逆轉。同樣，我們發現肝臟和腎臟中與脂肪酸氧化相關的關鍵轉錄物的表達因失血性休克而降低，但NMN傾向於僅在腎臟中恢復其中的一個子集（圖3，E和F）。因此，與脂肪酸氧化相關的轉錄物的mRNA表達與分離的線粒體氧化棕櫚醯肉鹼以及整個組織ATP水平的能力相關。
NMN和失血性休克影響NAD補救途徑中酶的表達。 為了更好地瞭解失血性休克對總NAD和線粒體NAD水平的影響，我們檢測了NAD補救途徑中酶的表達模式。代謝應激影響NAMPT的表達，增加NAMPT可以減輕多種模型的缺血損傷（15，17，24，25）。然而，NAMPT和下游酶NMNAT1–3的表達在失血性休克中尚未檢測過。休克後，腎臟和肝臟的NAMPT基因表達均有增加的趨勢（圖4，a和E）。在3種NMNAT亞型中，NMNAT1（核）和NMNAT3（線粒體）很容易被檢測到，而NMNAT2（據報道與高爾基複合體的胞質表面結合並存在於軸突中）沒有（11）。失血性休克和復甦對腎臟NMNAT1表達的影響很小，但對NMNAT3表達的影響不大。相反，兩種酶在肝組織中的表達均降低（圖4、C、D、G和H）。儘管NMN對假手術大鼠的NAMPT或NMNAT基因表達沒有影響，但相對於失血性休克後的對照組，它增強了NAMPT和NMNAT3的基因表達（圖4，A，D，E和H）。然而，休克與復甦結束時NAMPT蛋白表達的任何明顯變化無關（圖4，B和F）。這些結果表明NMN可以透過酶的表達影響NAD的代謝，而不是直接影響NAD的合成。
圖3。NMN維持複雜的I依賴性線粒體呼吸，提高線粒體NAD含量。失血性休克90分鐘後，復甦後1小時取組織（含或不含NMN 400 mg/kg）。從腎臟和肝臟組織中分離線粒體，並用高解析度呼吸測定法（對數標度）進行評估。在這兩種組織中，當使用NAD依賴性底物，如棕櫚醯肉鹼（PC）和丙酮酸/穀氨酸/蘋果酸（CI）時，發現呼吸功能缺陷。預處理和隨後的復甦，NMN完全恢復了腎臟的線粒體呼吸（A）和肝臟的CI底物的呼吸（B）。未經NMN處理，復甦後腎臟（C）中NAD含量保持不變，肝臟（D）中NAD含量增加。NMN處理增加了假手術和休克狀態下線粒體NAD水平（C和D）。n=5-6/治療組。資料用方框圖和耳語圖表示，方框表示IQR，線條表示中值，鬍鬚表示最小值和最大值。我們檢測了脂肪酸代謝關鍵酶的mRNA表達，包括肉鹼棕櫚醯轉移酶1（CPT1）、長鏈脂肪酸轉運蛋白1（SLC27A1）、烯醇輔酶A水合酶和3-羥醯基輔酶A脫氫酶（Ehhadh）、超長鏈醯基輔酶A脫氫酶（VLCAD）、長鏈醯基輔酶A脫氫酶（LCAD），中鏈醯基輔酶A脫氫酶（MACD）。失血性休克可降低肝臟和腎臟中與脂肪酸氧化相關的關鍵轉錄物的表達，但NMN傾向於僅在腎臟（E和F）中恢復其中的一個子集。如果具有統計學顯著性，則採用單因素方差分析對兩組進行事後雙尾Student t檢驗或Mann-Whitney檢驗。*P10
NMN減輕失血性休克和復甦後的炎症。 失血性休克和復甦導致促炎狀態，其特徵是細胞因子水平升高、氧化應激和胰島素抵抗高血糖。細胞因子IL-6的迴圈水平是死亡率的一個強有力的預測因子，直接靶向IL-6是有益的，這表明該途徑介導的炎症與失血性休克的病理效應高度相關（26，27）。考慮到NAD在調節sirtuin依賴性炎症途徑中的關鍵作用（28），我們假設NMN可能抑制失血性休克和復甦後的炎症反應。事實上，NMN預處理和復甦可顯著降低全身IL-6細胞因子水平
圖4。NMN增加失血性休克後NAMPT和NMNAT3的表達。失血性休克後，腎（a）和肝（E）中的NAMPT mRNA表達有增加的趨勢，NMN治療後進一步增強。NAMPT蛋白在兩種組織中的表達均不受休克的影響（B和F）。NMNAT1在腎臟（C）中的表達不受影響，但在肝臟休克和復甦後表達下降，且不受NMN（G）的影響。休克後腎臟中NMNAT3表達增加，肝臟中NMNAT3表達減少，但僅在休克動物（D和H）中NMN處理使兩種組織中的NMNAT3表達增強。n=5-12/治療組。資料用方框圖和耳語圖表示，方框表示IQR，線條表示中值，鬍鬚表示最小值和最大值。如果具有統計學顯著性，則採用單因素方差分析對兩組進行事後雙尾Student&apos；s t檢驗或Mann-Whitney檢驗。*P
並且趨向於降低TNF-α，同時顯著改善休克誘導的高血糖（圖5，A和B）。有趣的是，在假手術治療的動物中，基礎TNF-α顯著降低，這表明NMN可以對這一途徑產生有效的影響，儘管在休克期間抑制作用基本上被克服。在組織水平上，NMN也顯著改善了腎臟復甦後的細胞因子分佈（圖5C）。這些基因表達的變化是否反映了免疫細胞的浸潤，還是常駐細胞中炎症途徑的啟用，目前尚不清楚。相反，NMN對肝臟中炎症基因的誘導沒有影響（圖5D）。
NMN改善離體肝細胞線粒體功能。 由於NMN能改善炎症狀態，其對線粒體功能的有益作用可能是繼發於炎症的減輕或靶組織的直接保護作用。為了確定NMN是否直接影響細胞線粒體功能，我們將原代肝細胞暴露於假手術和休克大鼠血漿中。與迴圈炎症因子可引起線粒體功能障礙的假說一致，休克血漿處理的原代肝細胞顯著抑制CI依賴性呼吸。然而，當肝細胞與NMN共培養時，這種CI缺陷被完全阻止（圖6A）。
鑑於休克和假手術動物血漿中可能含有不同濃度的多種促炎細胞因子，我們還用固定濃度的IL-6處理原代肝細胞。在這些實驗中，與NMN的聯合治療再次完全防止了線粒體功能障礙（圖6B）。因此，NMN可以以細胞自主的方式保護線粒體功能，儘管迴圈IL-6的減少也可能有助於其在體內的淨效益。
有趣的是，IL-6治療對原代肝細胞NAD水平沒有顯著影響。然而，隨著NMN的加入，暴露於細胞因子的細胞的NAD幾乎比基線增加了一倍，這表明炎症增強了NMN的攝取或NAD生物合成途徑的酶活性，或減少了NAD的週轉（圖6C）。
NMN治療不會導致失血性休克後線粒體氧化損傷或整體乙醯化譜的重大變化。 考慮到SIRT1啟用與抗氧化劑表達增強之間的關係，我們檢測了關鍵抗氧化酶的表達以及線粒體中的氧化損傷。儘管NMN顯著增加了肝臟中GPX1的mRNA表達，但其對抗氧化基因mRNA表達的影響很小，並且在不同組織中不一致（補充圖2）。一直以來，NMN在復甦後1小時對線粒體脂質過氧化沒有可測量的影響（補充圖2C）。由於線粒體NAD水平可能影響主要線粒體脫乙醯酶SIRT3的活性，我們還研究了線粒體蛋白質的乙醯化狀態。與預期相反，NMN預處理導致假動物線粒體蛋白乙醯化適度增加，而復甦後無明顯差異（補充圖2B）。因此，無論是氧化損傷還是乙醯化的改變都不能很容易地解釋NMN治療後CI的功能差異。
NMN對器官功能的影響。 為了確定NMN是否儲存了器官功能，在復甦結束時從假動物和休克動物身上採集血樣，並檢測肝、腎和心功能不全的標誌物。儘管失血性休克和復甦導致肝臟和腎臟損傷標誌物顯著增加，但數值仍在正常範圍內，僅NMN治療動物的損傷有減少的趨勢（表1）。這些損傷標記物保持相對較低的事實很可能反映了檢查的早期時間點。然而，即使在這個早期，失血性休克和復甦也與肌酸激酶活性的增加有關，而肌酸激酶活性的增加可被NMN緩解。肌酸激酶水平可由骨骼肌或心肌損傷引起。在沒有擠壓傷的情況下，急性失血通常不會導致骨骼肌損傷，與心臟損傷的關係更密切（29）。因此，NMN可能具有心臟保護作用，值得進一步研究。
圖5。NMN可減輕失血性休克後的炎症反應。ELISA法測定血清IL-6和TNF-α水平。正如預期的那樣，兩種促炎細胞因子的血清水平隨著失血性休克而升高，而NMN顯著降低IL-6，並有改善TNF-α水平的趨勢（a）。促炎細胞因子的減少與休克後高血糖的減少相對應（B）。qPCR法檢測腎、肝組織中炎性細胞因子的表達。NMN可部分減輕腎臟中IL-6mrna的表達，但不能減輕肝臟中IL-6mrna的表達（C和D）。n=5-12/治療組。資料用方框圖和耳語圖表示，方框表示IQR，線條表示中值，鬍鬚表示最小值和最大值。如果具有統計學顯著性，則採用單因素方差分析對兩組進行事後雙尾Student t檢驗或Mann-Whitney檢驗。*Pα
NMN增強生理儲備，降低死亡率。 基於炎症狀態、乳酸代謝、線粒體功能的改善以及損傷生物標誌物減少的趨勢，我們推測NMN可增強失血性休克後的生理儲備和提高存活率。使用失代償性休克模型，我們進行了第二組實驗，以評估生理儲備，如動物在嚴重休克中無需復甦的總時間所示（圖7A）。儘管與對照組相比失血量相等或更大，但NMN預處理使動物承受嚴重休克的時間增加了近25%（圖7，B和C）。儘管經受了這種更劇烈的損傷，但接受NMN治療的動物仍保持較低的乳酸水平，並表現出更好的存活率（圖7，D和E）。因此，NMN預處理和隨後的復甦顯著提高了大鼠對失血性休克的耐受能力。
儘管NMN的預處理和隨後的復甦在預期出現重大手術失血（如心臟或血管手術）或創傷性損傷（如戰鬥）時可能有用，但我們想確定NMN是否可以在受傷後用於治療意外出血事件或創傷。為了解決這個問題，我們將動物置於失代償性失血性休克模型中，然後用LR+NMN（400mg/kg）復甦。儘管復甦期間給予NMN對該模型中的乳酸水平沒有影響，但它顯著提高了48小時存活率（圖7，D-F）。這些資料表明NMN治療即使在損傷後仍然有效，並且支援越來越多的文獻表明NAD前體可以減輕缺血/再灌注損傷（15，17，30，31）。
討論
在美國，外傷是45歲以下人群的主要死因，近40%的失血性休克患者在最初的24小時內死亡（32，33）。由於失血的嚴重程度和低灌注的持續時間與器官衰竭和死亡率直接相關，目前的復甦策略側重於快速修復損傷、恢復血容量和改善灌注壓。然而，如果休克狀態過於嚴重或持續時間過長，細胞代謝仍然受到抑制，復甦努力無法改善臨床結果。在失血性休克後，開發恢復和支援細胞代謝的治療方法有可能減輕器官功能障礙並提高存活率。
在長時間低灌注期間，由於NAD池的大小減少和向還原型（NADH）的轉變，NAD的可用性急劇下降。鑑於NAD在糖酵解、氧化磷酸化和促進細胞彈性的途徑中發揮的重要作用，我們研究了使用NMN恢復NAD水平作為失血性休克治療的可能益處（14，34，35）。儘管NMN對我們模型中的許多組織都有積極影響（13，36，37），但我們特別關注腎臟和肝臟的生物能學效應，因為這些器官在急性失血後有很高的衰竭風險（38，39）。在腎臟和肝臟，NMN預處理和隨後的復甦增加了NAD水平，恢復了NAD/NADH比率，改善了線粒體功能，減輕了炎症（圖8）。重要的是，NMN還增強了失血性休克時整個機體的生理彈性，提高了復甦後的存活率。因此，NMN有望作為一種治療輔助手段，值得進一步的臨床研究。
使用NMN恢復NAD最顯著的代謝效應之一是線粒體功能的改善。在失血性休克期間，當使用NAD連線的底物（如異檸檬酸鹽、α-酮戊二酸鹽和β-羥基丁酸鹽）時，線粒體呼吸出現進行性缺陷，表明嚴重失血優先抑制CI（1，40）。儘管NMN已被證明能改善衰老和阿爾茨海默病慢性模型中線粒體的整體呼吸能力（41，42），但我們的研究提供了我們所知的第一個資料，證明NMN完全維持失血性休克後CI依賴的線粒體呼吸。我們最初假設這次救援是
圖6。NMN在細胞因子暴露後拯救線粒體功能並增加離體肝細胞的NAD。與失血性休克動物血漿共培養24小時後，洋地黃素通透性分離的肝細胞表現出複合I依賴性呼吸的缺陷，NMN（100μM）（a）可減輕這種缺陷。當用IL-6（20 ng/ml）處理1小時時，分離的肝細胞出現整體線粒體功能障礙，每個複合物的呼吸能力降低，這透過與NMN（100μM）的協同處理得到緩解（B）。NMN僅在與IL-6（C）共處理的細胞中增加NAD水平。n=6–8/組。資料用方框圖和耳語圖表示，方框表示IQR，線條表示中值，鬍鬚表示最小值和最大值。如果有統計學意義，則採用單因素方差分析對兩組進行事後雙尾學生t檢驗或Mann-Whitney檢驗。*P
僅次於NMN緩解線粒體NAD下降的能力。然而，我們的資料並不支援這一假設。事實上，與我們觀察到的總組織NAD的下降相反，從對照動物身上獲取的線粒體在失血性休克後實際上保持或增加了NAD的水平。NMN處理的動物線粒體NAD水平進一步升高。雖然對失血性休克後線粒體NAD的濃度知之甚少，但我們的發現確實支援Hift和Strawitz關於“不可逆失血性休克”中從狗身上分離的肝線粒體中增加“光吸收物質”的描述，這些研究者將在265至270μm處發現的增加的分光光度吸收峰歸因於“核苷酸物質”（43）。回顧過去，這可能代表NADH，紫外吸收峰為259nm。儘管解釋線粒體NAD庫產生和維持的確切機制仍存在爭議，但線粒體NAD增加的發現表明，細胞質到線粒體的轉移增強或線粒體NAD迴圈增強（3）。在這兩種情況下，失血性休克後增加線粒體NAD的能力可能反映了對細胞應激的適應性反應，並表明細胞溶質NAD的減少可能比大量組織測量所顯示的更大。
考慮到線粒體NAD水平沒有降低，而且在失血性休克期間被儲存下來，NMN肯定有另一種機制使線粒體功能受益。CI易發生氧化損傷和功能障礙，可透過誘導抗氧化劑來挽救
結果分析採用單因素方差分析和雙尾t檢驗。
防禦（44–48）。增加核/胞漿NAD已被證明透過上調抗炎和抗氧化途徑調節對細胞應激的反應（49）。特別是，SIRT1使用NAD作為強制共基質去乙醯化巨噬細胞中NF-κB的RelA/p65亞單位，導致促炎細胞因子如IL-6和TNF-α的表達降低（50）。SIRT1還可能透過去乙醯化和啟用PGC1α來減輕缺血/再灌注損傷。反過來，PGC1α增加抗氧化酶以及SIRT3的表達，SIRT3是一種線粒體NAD依賴性脫乙醯酶，透過直接啟用異檸檬酸脫氫酶2和錳超氧化物歧化酶減輕線粒體氧化應激（51，52）。為了支援SIRT1的潛在作用，我們和其他人已經證明，用白藜蘆醇（一種SIRT1啟用劑）復甦可以改善線粒體功能，減輕炎症，減輕氧化損傷，改善失血性休克後的器官功能（53–56）。類似地，Jeong等人證明，大劑量口服煙酸（另一種NAD前體和SIRT1啟用劑）可減輕全身炎症，並與失血性休克齧齒動物模型中肺NF-κB表達減少和氧化應激有關（13）。在這項研究中，NMN減輕了全身和組織特異性炎症反應。重要的是，全身炎症的改變並不僅僅是線粒體功能改善的原因，因為NMN還保留了暴露於控制劑量的炎性細胞因子的通透性肝細胞的CI依賴性線粒體呼吸。因此，NMN似乎對炎症應激誘導的損傷也具有細胞自主的保護作用。
有趣的是，NMN拯救了腎臟和肝臟的NAD水平和線粒體功能，卻只儲存了腎臟的ATP。然而，ATP的總量受生產和消費的影響。在失血性休克期間，腎臟中的ATP消耗顯著減少，因為低血壓導致腎小球濾過減少，從而減少遠端腎單位對ATP依賴性再吸收的需要。相比之下，失血性休克期間肝臟中的ATP消耗實際上會增加，因為增加鈉內流需要增加Na-K ATP酶活性（57）。因此，未能在肝臟中拯救ATP可能並不反映NMN如何影響線粒體功能的組織差異，而是這兩個組織在休克期間經歷的能量應激程度的差異。++
與我們關於NMN的有希望的結果相反，先前的研究使用NAD、煙醯胺或煙酸作為NAD前體在失血性休克復甦期間輸注，儘管NAD濃度有所提高，但未能改善組織能量學或整體存活率（12）。與煙醯胺或煙酸相比，NMN的一個優點是它可以併入細胞NAD池，而無需能量昂貴的磷酸核糖基轉移酶步驟（14），這可能是能量應激細胞的一個關鍵區別。在這方面，煙醯胺核糖也可能是有趣的測試，因為它可以轉化為NMN細胞內的作用，煙醯胺核糖激酶（58）。在細胞中的實驗表明，NAD本身並不容易被完整地吸收，而是必須在穿過質膜之前被分解成煙醯胺核糖或煙醯胺（59）。因此，與Chaudry等人使用的NAD前體相比，NMN具有一些優勢，儘管其他因素，如復甦方案，也可能有助於我們研究的更好結果。事實上，我們在復甦過程中提供了比原來的Chaudry方法更多的液體，並推測持續的低灌注可能掩蓋了這些實驗中恢復的NAD的任何保護作用。此外，Jeong等人最近將口服煙酸與失血復甦相結合，以改善失血性休克後的肺損傷（13）。因此，在失血性休克中拒絕NAD前體作為治療劑可能還為時過早。
圖7。NMN增強失血性休克的耐受性。在誘導失血性休克之前，動物接受常規水或含400mg/kg/d NMN的水5天。然後將所有大鼠（n=11/組）失血至平均動脈血壓（MAP）40 mmHg，然後維持在40 mmHg，並增加液體丸量，直到恢復40%的血流量。然後用水預處理的動物在60分鐘內用4倍於乳酸林格氏液（對照組）或乳酸林格氏液（400 mg/kg NMN）中的脫落體積復甦（NMN治療後）。在飲用水中預處理NMN的動物也在60分鐘內用4倍於乳酸林格氏液中的脫落體積加上400 mg/kg NMN（NMN）進行復蘇。所有動物（對照組、NMN、NMN治療後）觀察48小時（A）。接受NMN預處理的動物在需要復甦前能夠比對照組維持休克狀態的時間更長（B），儘管失血的百分比相似（C）。與預期一樣，對照組動物和僅在復甦（NMN治療後）期間接受NMN的動物在休克時間和失血量方面相似。NMN預處理的動物復甦後血乳酸濃度低於對照動物（D）。無論給予NMN作為預處理和復甦輔助物（NMN），還是僅作為復甦期間的輔助物（NMN治療後），接受NMN治療的動物存活的可能性明顯高於對照組（E）。當NMN預處理和單純復甦策略相結合時，與對照組動物相比，NMN治療組動物有明顯的生存優勢（F）。資料表示為平均值±SEM。如果具有統計學顯著性，則採用單因素方差分析對兩組進行事後雙尾學生t檢驗或Mann-Whitney檢驗。生存率分析採用Kaplan-Meier曲線和log-rank-Mantel-Cox檢驗。*P
關於失血性休克中NAD挽救途徑的研究很少。我們想知道NAMPT或NMNAT表達的降低是否導致休克時NAD的消耗，或者是否存在代償反應。儘管缺血/再灌注損傷降低了心肌細胞中NAMPT的表達（22），但失血性休克似乎增加了肝臟中NAMPT mRNA的表達，並有增加腎臟中NAMPT mRNA表達的趨勢。令人驚訝的是，補充NMN進一步增強了復甦後兩種組織中的NAMPT mRNA表達，但在假NMN處理的對照組中沒有。我們還對確定失血性休克後NMNAT1–3的表達是否發生變化感興趣。NMNAT2沒有被可靠地檢測到，但是我們
圖8。NMN改善失血性休克的病理生理學。失血性休克導致組織灌注減少，再灌注損傷以組織NAD水平降低、氧化損傷、線粒體損傷和炎症為特徵。有趣的是，在失血性休克期間，線粒體NAD水平並沒有下降，反而上升。NMN預處理和復甦增加了組織和線粒體NAD的儲存，並與改善線粒體功能、減少炎症、改善生理儲備和降低死亡率有關，儘管對血壓或氧化損傷沒有重大影響。
我們能夠量化NMNAT1和NMNAT3的轉錄物，它們分別在細胞核/細胞質和線粒體中將NMN轉化為NAD。NMNAT1和NMNAT3均因肝臟休克而受到抑制，提示急性失血時該器官的NAD生物合成能力可能降低。相反，腎臟中NMNAT1不受影響，NMNAT3增加。有趣的是，NMN增強了休克後兩個器官NMNAT3的表達。與NAD生物合成相關的轉錄物的誘導，特別是當前體可用時，可能反映了對細胞應激的適應性反應，並可能解釋為什麼我們分離的肝細胞僅在IL-6和NMN存在下顯著增加NAD（23）。因此，失血性休克導致與NAD生物合成相關基因表達的器官特異性改變，我們揭示，在嚴重損傷的情況下，NMN對NAD庫的直接貢獻可能透過生物合成酶的誘導而增強。
雖然令人鼓舞，但我們的研究有一些侷限性。首先，NAD改善線粒體功能和存活的機制尚待完全闡明。鑑於失血性休克後線粒體NAD水平沒有降低，NMN恢復腎和肝線粒體功能的能力必須透過一種不同於NAD含量的途徑發生。失血性休克後的核或胞漿NAD缺乏可能透過改變NAD依賴酶（包括sirtuins、PARPs或CD38）的活性間接導致線粒體功能障礙（7、60、61）。其次，我們沒有研究治療的最佳時機或持續時間。這一點尤其重要，因為NAD增加的持續時間和SIRT1啟用的時間可能會影響急性炎症如何發展為更慢性的低炎症狀態（28）。最後，雖然我們確實看到了NMN治療動物失血性休克後器官功能改善的趨勢，但研究線粒體功能的早期變化需要在不適合這些測定的時間點處死大鼠；未來長時間的研究可能會加強這些發現。
總之，我們的研究結果表明NMN作為復甦的輔助手段具有重要的前景。在我們的嚴重失血性休克模型中，NMN透過增加組織NAD水平、維持細胞氧化還原比率和增強CI依賴的線粒體呼吸來支援細胞代謝。NMN似乎也具有抗炎特性，減弱全身炎症反應以及細胞因子暴露的細胞效應。重要的是，NMN的生物化學和免疫學優勢轉化為提高生理彈性。NMN預處理的動物能夠耐受較長時間的低灌注，用NMN復甦的動物表現出更好的存活率。鑑於這些令人鼓舞的臨床前研究結果，未來研究NMN在受傷患者中的治療潛力是有必要的。
方法
除非另有說明，所有化學品和細胞培養液均來自MilliporeSigma或Thermo Fisher Scientific。
動物和實驗程式。 雄性Long-Evans大鼠（250–300克，查爾斯河實驗室）被安置在恆溫、恆溼、定時12小時光/暗迴圈的環境中。在隨機分配給普通飲用水或含NMN（400 mg/kg/d，Metro International Biotech LLC贈送）的水之前，讓動物適應至少3天。在手術前5天，給動物提供標準大鼠食物（PMI齧齒動物飲食，LabDiet）和水（有或沒有NMN）。
使用面罩蒸發的異氟醚（2%–4%，MilliporeSigma）麻醉自主呼吸大鼠，並對其進行股骨血管導管的無菌放置（PE50，Braintree Scientific Inc。）。在整個實驗方案（數字訊號分析儀）中記錄MAP。無菌準備的5釐米中線剖腹手術被用來模擬軟組織損傷。所有手術部位均用1%利多卡因（APP Fresenius Kabi）浸泡並分層封閉。動物接受0。25%丁丙諾啡（0。05 mg/kg，皮下注射，Reckitt Benkiser Healthcare Ltd。）。然後將動物置於有機玻璃約束裝置中，讓其完全脫離麻醉狀態（約30分鐘）。
將動物隨機分為固定壓力失血性休克組（每個治療組9-12只）或假對照組（每個治療組5只）。休克動物透過股動脈被動失血，並在40 mmHg的MAP下維持90分鐘。如果MAP低於40 mmHg，則提供小劑量（0。2 ml）靜脈注射LR以維持MAP。在90分鐘時，在60分鐘（60R）內，用4倍於LR中的血容量靜脈復甦動物，加入或不加入無菌過濾NMN（400 mg/kg）。將假動物輕輕抑制90分鐘，然後在60分鐘內給予5 ml LR（含或不含無菌過濾NMN（400 mg/kg））。在基線、90分鐘和60分鐘時採集血樣（圖1）。復甦後，動物再次用異氟醚（2%–4%，千分之一）麻醉。休克90min或60R後迅速切取肝、腎組織，麻醉下處死動物。
為了進行存活實驗，在手術前將動物隨機分為有或沒有NMN（400 mg/kg/d）的水5天。動物接受全身麻醉，血管通路，剖腹手術和完全反轉。然後將動物隨機分為失代償性失血性休克組（n=11/治療組）或假對照組（n=5/治療組）（62）。休克動物透過股動脈被動失血，並維持在40mmHg的MAP。當血壓在沒有輸液（失代償）的情況下無法維持時，透過遞增地輸注0。2毫升LR維持40毫米汞柱的MAP，直到40%的總流出量以丸的形式返回（嚴重休克）。然後，用4倍於LR中的棚容量（含或不含NMN（400 mg/kg））復甦動物60分鐘，並再觀察48小時（圖7）。從開始出血到開始復甦的總時間代表了每隻動物對休克的耐受能力，並反映了個體的生理恢復能力。動物在24小時接受丁丙諾啡（0。05毫克/千克，每8小時一次）和皮下注射LR丸（50毫升/千克）加或不加NMN（400毫克/千克）。在基線、嚴重休克、60R和48小時採集血樣。48小時後，所有存活的動物用異氟醚（2%–4%）透過面罩麻醉，然後進行組織採集和安樂死。
在一組單獨的實驗中，僅用水預處理的動物如前所述遭受失代償性失血性休克，並在60分鐘內用4倍於棚容的LR加NMN（400 mg/kg）復甦，然後再持續48小時（圖8）。動物在24小時接受丁丙諾啡（0。05毫克/千克，每8小時一次）和皮下注射LR丸（50毫升/千克）加或不加NMN（400毫克/千克）。在基線、嚴重休克、60R和48小時採集血樣。48小時後，所有存活的動物用異氟醚（2%–4%）透過面罩麻醉，然後進行組織採集和安樂死。
原代肝細胞的分離如前所述，採用改進的兩步灌注法（63）。用異氟醚（2%–4%）麻醉動物（n=4）。腹部準備好，並以無菌方式覆蓋。用24g血管導管插管下腔靜脈，切斷門靜脈。然後以17 ml/kg/min的速度向肝臟注入300 ml肝臟灌注介質（Invitrogen，17701-038）以脫鹽，然後注入400 ml肝臟消化介質（Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩衝液［KRBB］+20 mM HEPES［pH 7。4］［MilliporeSigma，Thermo Fisher Scientific］、500μM CaCl膠原酶［≥20000單位］/彈性蛋白酶［30單位］［LK002066，沃辛頓］和DNAse I［200臺，LK003170，沃辛頓］）。灌注完成後，取下肝臟，用細胞刮刀破壞肝臟釋放細胞。然後透過70μm過濾器過濾細胞懸浮液，並在4°C下以50 g離心5分鐘，在KRBB中洗滌一次，並在4°C下以120 g的25%Percoll梯度沉澱5分鐘。將細胞再懸浮在肝細胞培養基（M199，NaHCO3［2。2 g/l］）、谷氨醯胺0。1 g/l、0。25%BSA、10%胎牛血清（Hyclone）中，1%青黴素鏈黴素。使用預先塗覆的膠原6孔板，細胞以1×10細胞/孔的速度被鍍，並且培養12小時（37°C，5%CO）。2，62
為了獲得用於肝細胞共培養實驗的假血漿和休克血漿，按照所述麻醉動物，進行血管插管，並在出血前使其甦醒和穩定。假手術組（n=9）迅速失血至肝素化收集管（BD Vacutainer），確認乳酸≤2 mmol/l，休克組（n=9）失血至40 mmHg，持續90 min，然後失血至肝素化收集管。採集的血液立即離心（1300 rcf，10分鐘，4℃），血漿立即儲存在–80℃下。
血液化學和炎性細胞因子。 使用point of care獸醫藥筒（i-STAT，Abbot point of care Inc。）對血液進行動脈血氣、乳酸、血紅蛋白、葡萄糖和血尿素氮的測定。血清肌酐、天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶和肌酐激酶使用市售試劑盒（Pointe Scientific）進行分光光度分析。採用酶聯免疫吸附試驗（Invitrogen）檢測IL-6和TNF-α。
NAD/NADH分析。 NAD從冷凍組織樣品（50mg）、分離的線粒體（100μg）或原代肝細胞（1×10個細胞）中提取，置於0。6m高氯酸中（賽默飛世爾科技公司）。用組織溶解器（Qiagen）在20hz下使組織均勻化1分鐘。線粒體和細胞劇烈旋轉30-45秒。離心10分鐘（15000 g，4°C）後，去除透明上清液，並在pH值為8（賽默飛世爾科技）的100 mM冰磷酸鈉緩衝液中稀釋1：100。使用改良的Graeff和Lee酶迴圈分析法（64），在96孔格式中測量NAD。簡言之，將5μl NAD標準品和稀釋的組織提取物與95μl迴圈混合物（0。2%乙醇、0。11/ml乙醇脫氫酶、1。1 mg/ml黃遞酶、20μM瑞蘇林、10μM黃素單核苷酸、10 mM煙醯胺和0。1 mg/ml BSA，置於100 mM磷酸鹽緩衝液中，pH 8。0，均來自Thermo Fisher Scientific）。採用分光光度法（544nm激發，590nm發射，Synergy H1，Biotek）根據resorufin累積速率測定NAD濃度。6
NADH從冷凍組織（50mg）和分離的線粒體（100μ）中提取，置於冰冷提取緩衝液中（0。25nkoh，50%ETOH，Thermo-Fisher-Scientific）。樣品均化和離心如所述。去除上清液並在55℃下加熱10分鐘以水解遊離NAD。在冰涼的100 mM磷酸鈉緩衝液（1：50）中稀釋後，使用所述酶迴圈測定法測定樣品。使用Pierce BCA蛋白質分析試劑盒（Thermo Fisher Scientific）測定NAD和NADH提取微丸中的蛋白質濃度。克
原代肝細胞。 原代肝細胞在體外培養12h後用PBS洗滌。細胞用無菌過濾血漿（0。22μm，Thermo Fisher Scientific）處理，在休克和假手術條件下收穫，加入和不加入NMN（100 nM）24小時。臺盼藍排斥法測定細胞存活率（89%–96%存活率），各組間無差異。
在一個單獨的實驗中，肝細胞在初次電鍍12小時後用PBS清洗，並將培養基改為Dulbecco改良Eagle&apos；s培養基和含1%青黴素鏈黴素（MilliporeSigma）的10%FBS培養基。用重組大鼠IL-6（20ng/ml，SRP4145，miliporesigma）和不用100μM NMN處理細胞1小時。存活率在96%-98%之間，治療組之間沒有差異。立即使用高解析度呼吸測定法對細胞進行評估，或用0。6 M高氯酸處理細胞，並在–80°C下儲存，直到測定NAD。
ATP測定。 根據製造商的說明，使用市售ATP測定試劑盒（Life Technologies）測量冷凍組織（50 mg）中的ATP。
線粒體的分離。 立即將肝和腎組織（4–6 g）浸入冰冷的線粒體分離緩衝液（MIB）（210 mM甘露醇、70 mM蔗糖、10 mM HEPES、1 mM EDTA，使用KOH將最終pH調節至7。2，並新鮮補充0。5%不含脂肪酸的BSA，均來自Thermo Fisher Scientific）。組織在含有5%BSA的MIB中均質化，並且如前所述使用差速離心分離線粒體（53，55）。最後的線粒體顆粒在MIB中再懸浮或用0。6 M高氯酸處理以進行NAD測量。蛋白質濃度透過皮爾斯BCA蛋白質測定法（Thermo Fisher Scientific）測定。
線粒體呼吸容量的高解析度測定。 採用標準底物/抑制劑滴定法對線粒體呼吸功能進行功能分析（53，55）。新鮮分離的線粒體（0。15 mg）重新懸浮在呼吸介質（110 mM甘露醇、0。5 mM EGTA、3 mM MgCl、20 mM牛磺酸、10 mM KHPO、60 mM K乳糖酸鹽、0。3 mM DTT和0。1%BSA［不含脂肪酸］）中，用KOH將pH值調整為7。1，均來自Thermo Fisher Scientific）（65）。在37°C下用高解析度呼吸測定法測量耗氧量，並持續攪拌（Oxygraph-2k，Oroboros儀器）。穩定後（3–5分鐘），連續收集實時氧氣濃度和流量資料（DatLab軟體4。3，Oroboros儀器）。記錄基礎呼吸頻率後，向呼吸室中加入10mM穀氨酸、5mM蘋果酸和1mM ADP誘導CI依賴性呼吸。為了測定CII依賴性呼吸，加入魚藤酮（0。5μM），一種選擇性CI抑制劑，然後加入10mm琥珀酸鹽。然後加入抗黴素A（5μM）抑制複合物III；然後加入TMPD（0。5 mM）和抗壞血酸（2 mM）作為複合物IV的人工底物。該方案在60分鐘內完成。（所有試劑均從賽默飛世爾科技公司購買。）224
同樣，分離的肝細胞（2。5×10個細胞）在呼吸緩衝液中再懸浮，並使用高解析度呼吸測定法進行分析。穩定後，記錄基線耗氧量，將細胞通透性地黃皂甙（3μg）穩定10分鐘。細胞然後接受用於分離線粒體的底物/抑制劑滴定方案。5
免疫印跡。 對於Western印跡分析，使用組織裂解器（Qiagen）在補充有磷酸酶抑制劑（Phostop，Roche）、蛋白酶抑制劑（Complete，Roche）、煙醯胺（1 mM）和曲古抑素A（1μM）的RIPA緩衝液中裂解冷凍肝和腎組織。將裂解物離心15分鐘（15000 g，4°C）。裂解物在25%laemmli緩衝液+BME中於95℃變性5分鐘，並在4%–15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳凝膠上解析。將凝膠轉移到用脫脂豆奶（66）封閉的聚偏氟乙烯膜（MilliporeSigma）上，並使用抗NAMPT（1：5000，SC67020，Santa Cruz）、抗羥基壬醛（1：1000，Abcam）或抗乙醯化賴氨酸（1：1000，細胞訊號），然後使用抗肌動蛋白（1：10000，Abcam）或抗VDAC抗體（1：1000，親和生物）進行探測膜剝離後，在含0。1%吐溫20的Tris緩衝鹽水中。用辣根過氧化物酶結合二級抗體和Western-lighting-Plus-ECL（Perkin-Elmer）化學發光法檢測目的蛋白。利用Bio-Rad成像站獲取影象，並使用imagej（國立衛生研究院）進行量化。
基因表達。 用Trizol（MilliporeSigma）和乙醇沉澱法從冷凍組織中提取肝和腎RNA。根據製造商的建議，使用高容量cDNA逆轉錄酶試劑盒（Applied Biosystems）使用RNA（1μg）產生cDNA。使用Applied Biosystems 7900HT系統和SYBR green（Applied Biosystems）進行實時PCR。每個樣本獲得兩個技術重複，並使用ΔΔCT方法計算相對mRNA表達水平，標準化為肌動蛋白作為管家基因。使用以下引物：β-肌動蛋白（正向，ggctgtattccccccatcg；反向，ccagtgaacaatgcatgt）、IL-6（正向，tagtcttcctaccacacatcc；反向，ttggtcttagccatcc）、TNF-α（正向，ctgtgcctcagctctc；反向，actgatgaggaggccat）、NAMPT（正向，tctgaatcgcatccagacac；反向，tatccatccccccccccccccttcga）、NMNAT1（正向，CAGAGCATCCGCTACTTGGT；反向，ATCGGGAGATGGTGT）、NMNAT2（正向，TCTGATGGATCAGGTGGA；反向，ATGGTGCTCTCACACACTGC）和NMNAT3（正向，CCTGCGTTTGTTTGTGG；反向，ATGATCGCGCATCCACT）。
統計。 結果以平均值±SEM表示。根據資料分佈的正態性，採用雙尾Student&apos；s t檢驗或Mann-Whitney檢驗對兩組進行比較。單因素方差分析用於比較3個或更多組，如果有統計學意義（P2
研究批准。 所有的實驗都是由賓夕法尼亞大學的機構動物護理和使用委員會批准的，並且是按照美國國立衛生研究院制定的指導方針進行的。
致謝
我們要感謝James G。Davies、Karthikeyani Chellappa和Qingwei Chu提供的技術援助。這項工作部分得到了美國國立衛生研究院的資助（K08 GM97614、R01 DK098656和R01 AG043483）。NMN是由麥德龍國際生物技術公司提供的，這項工作得到了E。Schulak的一份禮物的部分支援。兩人都沒有參與資料分析、解釋，也沒有參與手稿的編寫，這完全是作者的工作。
以上內容由康特生物科技有限公司為研發康特NMN所提供的內部資料，僅供學習參考。