撰文：步步先生
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目前全球有約4。6億糖尿病患者，每年有420萬人死於糖尿病，我國有近1。3億糖尿病患者。在 1 型糖尿病中，胰島β細胞遭到機體免疫系統無情地破壞，部分或完全失去了分泌胰島素的功能，造成體內胰島素絕對缺乏，引起了血糖水平持續升高，於是糖尿病出現了。胰島移植雖可以改善患者的胰島素不足問題，但是供源不足，臨床上無法大規模開展。
近年來，蓬勃發展的幹細胞技術，解決了一部分細胞來源問題，但是也存在侷限性——胰島β細胞的轉化率低、穩定性差等。因而，建立一個穩定而高效的胰島β細胞製備方案很重要。
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胰島β細胞是目標
胰島與胰島素
1 型糖尿病是由胰島β細胞受損，導致胰島素分泌絕對不足造成的。人體的胰島素來源胰島，胰島是許多大小不等和形狀不定的細胞團，散佈在胰腺的各處。胰島中的細胞主要由α細胞，β細胞，δ細胞和pp細胞組成。
1型糖尿病發病機制
胰島素是機體內唯一可以降低血糖的激素，由胰島β細胞分泌而來。針對 1 型糖尿病，想要拯救分泌不足的胰島素，生產源源不斷的可分泌胰島素的 β細胞是目標。
胰島β細胞是目標
科學家們早已實現了在實驗室從人源多能幹細胞（hPSC）製備功能性β細胞，但是轉化效率一直很低（僅有10~40%）。相比之下，製備神經細胞的效率較高，約80%。另一個問題是，如果未分化的細胞留在混合物中，它們最終可能變成另一種不需要的細胞，移植人體後可能有長成畸胎瘤的風險。
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轉化率最高的β細胞製備法
前不久，美國Salk研究所的研究團隊開發了
一個迄今轉化率最高的
人源多能幹細胞向胰島 β 細胞方案，轉化效率可達80%，穩定性高，且對細胞系的依賴性低
。當在小鼠模型中進行測試時，動物的血糖在兩週內得到控制。這項研究發表在
Nature
子刊
Nature Communications
上，題目如下：Chemical combinations potentiate human pluripotent stem cell-derived 3D pancreatic progenitor clusters toward functional β cells
研究思路
圖 研究方案示意圖
1。 將hPSCs誘導分化成胰腺祖細胞3D簇。
2。 將胰腺祖細胞3D簇分化成胰島β細胞。
3。 證實在體外，可響應高濃度葡萄糖的刺激而釋放胰島素。
4。 證實在體內，可在降低糖尿病小鼠的高血糖。
胰腺祖細胞3D簇的高效生成線路圖
第一階段，生成胰腺祖細胞3D簇
。簡單地說，將hPSCs逐步誘導，變成內胚層（透過CHIR99021和Activin-A誘導）、再誘導成原始腸管（透過KGF、Vc和dorsomorphin）、接著後前腸（透過KGF、Noggin、SANT1、RA和Vc）和胰腺祖細胞3D簇（透過EGF、Vc、煙醯胺和Noggin）。其中，Activin-A劑量很關鍵。此外，還要摸索分化和增殖之間的平衡，因為這直接影響胰腺祖細胞3D簇的最終生成效率。
10種化合物在胰腺祖細胞3D簇生成中的妙用
第二階段，胰腺祖細胞3D簇分化成熟β細胞。
採取分步法來製備胰島β細胞，研究發現有10 種化合物不僅在胰腺3D 細胞簇中保留了胰腺祖細胞，還增強向 NKX6。1+/INS+ β 細胞的分化潛力。也就是說，
這10種化合物組合可增強胰腺祖細胞3D簇向功能性胰島β細胞分化，其分化效率可高達80%
。
十種化合物
LDN（BMP 訊號通路抑制劑）
T3（三碘甲狀腺原氨酸）
RA（維甲酸）
SANT1（hedgehog 訊號通路抑制劑）
Repsox（ALK5 抑制劑）
ZnSO4（硫酸鋅）
（2S，5S）-（E，E）-8-（5-（4-（三氟甲基）苯基）-2，4-戊二烯醯氨基）苯內醯胺（TPB，一種蛋白激酶 C 啟用劑）
EGF（表皮生長因子）
NICO（煙醯胺，一種維生素）
γ-氨基丁酸（GABA，一種神經遞質）
體外功能實驗
體外葡萄糖刺激實驗
體外葡萄糖刺激實驗表明，成熟β細胞（第8期）對高濃度葡萄糖（16。7mM）刺激有反應，但對低濃度葡萄糖（3。3 mM）無反應，並釋放出人C肽。相反，未成熟β細胞（第7期）對高濃度葡萄糖（16。7mM）刺激沒有反應。成熟β細胞（第8期）也對其他促分泌物有反應，包括Exendin-4和KCl。
此外，研究者還測量了成熟β細胞（第8期）分泌的總胰島素含量，即每10000個細胞約62ng，這一數值與人類原代胰島中的數值相當。
體內功能實驗
動物模型：鏈脲佐菌素
（STZ）
誘導製得糖尿病小鼠模型。
移植位置：腎包膜
動物模型製備：將小鼠透過腹腔注射STZ連續4天，以誘導糖尿病。當連續4天血糖測量值高於250mg/dl時，小鼠被認為是糖尿病。
動物實驗：每隻糖尿病小鼠模型的腎包膜下移植160萬個β細胞（即8個3D簇），“不治療”被當作假手術。對於體內葡萄糖刺激的C肽分泌試驗，細胞移植後5周，在禁食過夜和靜脈注射葡萄糖丸（2g/kg）測得。
β細胞的體內功能實驗
動物實驗表明，
移植成熟β細胞到糖尿病小鼠的腎包膜下，糖尿病小鼠在兩週內恢復到正常血糖水平，而成纖維細胞移植組作為對照的糖尿病小鼠依舊維持高血糖狀態。
C肽分泌實驗顯示，成熟β細胞移植組的糖尿病小鼠體內有大量的人源C肽分泌。與禁食狀態（葡萄糖刺激前）相比，在葡萄糖刺激後檢測到的C肽增加了約兩倍。
移植後20周，沒有形成畸胎瘤。
研究者發現，本方案對細胞系依賴比較低，在其它細胞系中也可表現出很高的分化效率，終產物中非目標細胞比較少，且移植後沒有發現出現崎胎瘤。
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文末小結
從多能幹細胞到功能性β細胞的高效生成，一直是再生醫學領域的難題。本研究解決了其轉化效率低和穩定差的問題。這一套新的分化體系，可以源源不斷地獲得功能性胰島β細胞。在開始人體臨床試驗之前，還需要進行更多的研究來評估安全性問題。考慮到這套分化體系步驟較多，產業轉化也是一個難題。
回顧往期，路漫漫其修遠兮，吾將上下而求索。我們將持續關注細胞治療糖尿病，直到糖尿病被治癒的那一天。
參考文獻：
Liu Haisong et al。， Chemical combinations potentiate human pluripotent stem cell-derived 3D pancreatic progenitor clusters toward functional β cells。
Nature Communications
， 2021
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