發酵是一個複雜的過程，微生物將植物中的糖分轉化為乙醇、二氧化碳和其他副產物併發揮了積極作用。發酵不僅能夠提高食品的風味和延長貨架期，而且能提高生物功能性，如促進新陳代謝、調節酸鹼平衡、調節腸胃功能、提高免疫力和營養成分利用率等。發酵一方面透過增加植物性食品中酚類化合物和黃酮類化合物含量來提高其抗氧化活性，另一方面發酵導致植物細胞壁被破壞，釋放抗氧化物質。
目前關於獼猴桃發酵相關研究主要集中在純獼猴桃汁或獼猴桃酒，對於獼猴桃果渣發酵工藝及抗氧化活性和感官分析研究較少。植物性發酵食品在國際市場有廣泛的發展空間，相應的產品也逐漸商業化，隨著發酵產品的快速發展，發酵產品逐步從飼料擴充套件到化妝品、藥品和食品等行業。雖然已有不少關於獼猴桃發酵工藝研究報道，但是不同獼猴桃品種和地域對於發酵有很大影響，且雙正交方法深入探索紅陽獼猴桃全果發酵最佳化工藝尚未有系統報道。因此本研究以新鮮紅陽獼猴桃為原料，以酵母和乳酸菌為複合發酵菌種製備獼猴桃酵素。
試驗透過雙正交方法對其發酵工藝引數進行最佳化，並在最優發酵工藝條件下研究酵素產品抗氧化能力和感官評價，目的獲得具有高品質的紅陽獼猴酵素產品並推動當地特色農產品深加工產品開發。
材料與方法
紅陽獼猴桃，酵母，果膠酶，纖維素酶，乳酸菌，食品級檸檬酸，去離子水，DPPH、ABTS等，K3［Fe（CN）6］，氨基水楊酸，無水乙醇等試劑（分析純），LRH-300生化培養箱，，A5176024立式自動壓力蒸汽滅菌器，FA2004電子天平，SP-756紫外可見光分光光度計，PAL-BX手持糖度儀，PH-100A筆試酸度計。
實驗方法
設計單因素試驗，確定酵母、乳酸菌、果膠酶和纖維素酶水平範圍並進行第一次正交試驗，在其基礎上根據相關文獻設計初始糖新增量、發酵溫度、時間和料液比單因素試驗，接著進行第二次正交試驗。根據兩次正交試驗結果確定紅陽獼猴桃酵素髮酵工藝最佳化條件。
資料分析
資料首先採用Microsoft Excel軟體進行統計，方差分析和顯著性分析採用SPSS version16。0統計。每項實驗至少進行3次，結果以平均值±標準差表示。
結果與討論
發酵菌種和酶的新增量單因素試驗結果羥基自由基是最具有活性的自由基，對鄰近生物分子具有誘導作用並造成重要損害。感官評價能對發酵產品所表現出的感官元素做出直觀評價。因此獼猴桃酵素的綜合指標由羥基自由基清除率（50%）和感官評價（50%）兩個方面組成。
合適的菌種和酶能夠有效促進獼猴桃發酵，張晶等發現複合菌發酵能提高野生獼猴酒風味，增加醇類、酯類化合物。彭寧等在獼猴桃酵素工藝條件研究中發現菌種接種量對獼猴桃發酵質量影響最大，因此本實驗首先確定發酵菌種和酶新增量，透過單因素實驗酵母、乳酸菌、果膠酶和纖維素酶對獼猴桃綜合指標的影響。本實驗在新增釀酒酵母同時新增乳酸菌共同發酵，一方面酵母為乳酸菌提高可溶性氮化合物，另一方面乳酸菌為酵母生長提供適宜的酸環境。纖維素酶和果膠酶能提高植物中大分子物質的分解，提高發酵效率。已有研究證實獼猴桃的膳食纖維，尤其是非澱粉多糖幾乎全部來自植物細胞壁。同樣，果膠廣泛存在於水果細胞壁，分子量大且不容易水影響發酵效率。透過果膠酶和纖維素酶處理的獼猴桃比非酶處理一方面提高大分子物質釋放和分解，另一方面能促進發酵微生物生長活力。
發酵條件單因素試驗結果
初始糖新增量為獼猴桃發酵提供必要的碳源，從圖 2A看到，隨著初始糖新增量的增加，評價指標逐漸升高，當初始糖度新增量超過20%，菌種生長活性受到限制，綜合指標開始下降。同樣，在發酵環境中，適宜的溫度能促進微生物生長以及各種酶類酶解活性，有效的釋放和合成活性物質，如黃酮、多酚等。從圖2B看到，發酵溫度超過36℃，酶活性和微生物生長受到影響。發酵時間是覺得發酵物質量的重要因素，從圖2C看到獼猴桃發酵液綜合指標隨著發酵時間的變化關係，發酵第28d指標最高，因此發酵時間選擇範圍為21~35d。料液比是影響發酵的關鍵因素之一，料液比過低抗氧化活性弱，反之發酵成本增高。從圖2D看到，料液比達到1：1。7發酵液綜合指標達到最高。
發酵菌種和酶新增量正交試驗結果
根據酵母、乳酸菌、果膠酶和纖維素酶新增量因素水平表 L9（34），以綜合指標為評價標準，進行發酵菌種和酶新增量進行正交試驗並對結果進行方方差分析，確定最佳新增量（表1、2）。由表4可知，影響羥基自由基清除率的因素，從主到次為酵母>乳酸菌>果膠酶>纖維素酶；感官方面影響因素為酵母>果膠酶>纖維素酶>乳酸菌。分別以極值最小的因素為誤差項進行方差分析（表2），影響羥基自由基清除率因素，酵母與乳酸菌新增量有顯著影響；影響感官評價因素，酵母有顯著影響。對於綜合指標，影響因素為酵母>乳酸菌>纖維素酶>果膠酶，以極值最小果膠酶為誤差項，酵母和乳酸菌有顯著影響，故確定最佳化新增量為：酵母、乳酸菌和纖維素酶各2。0%，果膠酶 0。5%。
表1 獼猴桃酵素髮酵菌種和酶新增量正交試驗結果
表2 獼猴桃酵素髮酵菌種和酶新增量正交試驗結果方差分析
發酵條件正交試驗結果
在菌種和酶新增量實驗結果基礎上，根據發酵條件單因素試驗結果，選取獼猴桃酵素對羥基自由基清除率影響各因素進行正交試驗，並對結果進行方差分析，確定最佳發酵條件（表3、4）。由表6可知，影響羥基自由基清除率的因素和感官方面影響因素，從主到次為初始糖度>料液比>發酵時間>發酵溫度。分別以極值最小的因素為誤差項進行方差分析（表4），影響羥基自由基清除率因素和影響感官評價因素，初始糖新增量、發酵時間和料液比均有顯著影響。對於綜合指標，影響因素和顯著影響結果與各指標一致，即初始糖度>料液比>發酵時間>發酵溫度，故確定最佳化發酵條件為20%初始糖新增量，料液比為1：1。3，36℃發酵35d。
表3 獼猴桃酵素髮酵條件正交試驗結果
表4 獼猴桃酵素髮酵條件正交試驗結果方差分析
最優發酵工藝驗證試驗
按照雙正交試驗結果最佳發酵條件和工藝進行3次驗證實驗結果表明（表8），最佳化後獼猴桃酵素的羥基自由基清除率、感官評價以及綜合指標分別為94。33%、76。33 和 85。33，實驗結果均高於正交實驗測得的結果，表明正交實驗獲得的紅陽獼猴桃酵素在羥基自由基清除率和感官評價方面均得到最佳化。
表5 獼猴桃發酵工藝驗證試驗結果
獼猴桃酵素抗氧化效果比較
根據最佳發酵工藝製備獼猴桃發酵工藝最佳化組，以未新增酵母、乳酸菌、果膠酶和纖維素酶的獼猴桃為對照組。兩組獼猴桃均在 20%初始糖新增量和料液1：1。3情況下發酵，且工藝最佳化組發酵溫度為 36℃，對照組為室溫發酵。發酵35d 後考察兩組羥基自由基清除率、DPPH·和 ABTS·+清除自由基情況。由於獼猴桃皮渣和籽中含有大量色素、多酚及單寧等物質，對於發酵果汁或酒類的感官有影響，因此關於獼猴桃發酵研究大多圍繞獼猴桃汁液，全果發酵工藝相對較少。近年來水果皮渣發酵相關研究逐漸成為熱點，其原因為帶皮發酵可以提高乙酸、總黃酮、總酚等功效成分含量並且賦予發酵物飽滿豐富的香味特徵。另外，有研究發現儘管帶渣發酵中總花色苷含量低於清汁發酵，但帶渣發酵能促進皮渣中黃酮等物質溶出，顯著提高發酵產品總酚含量和抗氧化活性。從圖3看到，經過最佳化後的獼猴桃酵素羥基自由基清除率、DPPH·和 ABTS·+自由基清除率均增強。與對照組相比，最佳化發酵後羥基自由基清除率、DPPH·和ABTS·+自由基清除率分別增加了8。69%、11。89%和36。57%，說明酵母、乳酸菌、果膠酶和纖維素酶能夠有效的提高獼猴桃發酵效率和活力，且全果發酵能夠提高發酵物多酚及單寧含量進而增強抗氧化活性。另外適宜的發酵溫度對獼猴桃酵素抗氧化效果起到積極作用。
結論
本試驗以羥基自由基清除率（50%）和感官評價（50%）為綜合指標，採用雙正交實驗方法進行獼猴桃發酵工藝最佳化。本實驗首先確定發酵菌種和酶新增量，透過單因素實驗酵母、乳酸菌、果膠酶和纖維素酶對獼猴桃綜合指標的影響。在此基礎上進行正交實驗，實驗結果表明酵母和乳酸菌為最主要因素，且具有顯著性。發酵菌種和酶新增量分別為：2%酵母，2%乳酸菌，0。5%果膠酶和 2%纖維素酶。然後在進一步考察發酵最佳條件，透過單因素實驗分析初始糖新增量、發酵溫度、發酵時間和料液比對獼猴桃綜合指標的影響。正交實驗結果表明初始糖新增量、發酵時間和料液比為主要因素，且達到顯著程度。最佳發酵工藝為20%初始糖新增量，料液比1：1。3（g/mL），36℃發酵35d。最佳化後獼猴桃酵素的羥基自由基清除率、感官評價以及綜合指標分別為94。33%、76。33和85。33，實驗結果均高於正交實驗測得的結果。最佳化發酵後測得紅陽獼猴桃酵素抗氧化活性發現，羥基自由基清除率、DPPH·和 ABTS·+自由基清除率分別增加了8。69%、11。89%和 36。57%，優於自然發酵獼猴桃。
本試驗以獼猴桃全果進行發酵，透過微生物代謝 獲得具有營養價值和保健功能的獼猴桃酵素產品，可 以進一步提升獼猴桃開發利用價值。另外，紅陽獼猴桃發酵過程中各階段不同成分和活性變化還需要進一步研究和分析。
