導語

流行病學研究一再表明，生物鐘的紊亂與代謝紊亂之間存在關聯。倒班工作是心血管事件的一個危險因素，但潛在機制仍不清楚。血漿脂質水平的晝夜變化不受食物攝入的影響，這表明生物鐘是脂質代謝的重要調節器，此外免疫系統的功能也與生物鐘有關，因此紊亂的生物鐘可能透過影響血脂和促進炎症發展導致動脈粥樣硬化。

【Ref：Schilperoort M ，  Berg R ，  Bosmans L A ， et al。 Disruption of circadian rhythm by alternating light‐dark cycles aggravates atherosclerosis development in APOE*3‐Leiden。CETP mice［J］。 Journal of Pineal Research， 2020， 68。】

重要實驗方法

1、

動物模型

：雜合APOE*3‐Leiden基因的小鼠與純合表達人膽固醇酯轉移蛋白（CETP）的小鼠雜交，獲得雜合APOE*3‐Leiden小鼠。

2、

流式細胞技術

：流式細胞術工作原理是在細胞分子水平上透過單克隆抗體對單個細胞或其他生物粒子進行多引數、快速的定量分析。它可以高速分析上萬個細胞，並能同時從一個細胞中測得多個引數，具有速度快、精度高、準確性好的優點，是當代最先進的細胞定量分析技術之一。

3、

免疫熒光染色

：用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法，用於檢測或定位各種抗原及抗體。

研究結果

一、週期性進行光暗交替擾亂生物鐘可以促進動脈粥樣硬化的發展

研究者將小鼠分為四組，光照和遮光時間分別為12h的LD組，每週經行光暗12h輪流處理的LD-DL組，每週光照和遮光時間延後6h的Advance組以及延後6h的Delay組。在15周時，研究者發現LD-DL組的主動脈根部動脈粥樣硬化病變區域明顯增加，而Advance和Delay組沒有顯著增加。隨後，研究者為探究每週光照是否會透過改變脂質代謝而加重動脈粥樣硬化的發展，研究者減少實驗組小鼠的食物攝入量，透過比較發現，在15周額干預後，兩組的小鼠的體重、血漿總膽固醇、非HDL-膽固醇和HDL-膽固醇水平，以及代謝器官和性腺白色脂肪組織均相同。

二、週期性進行光暗交替可以增加病變部位巨噬細胞聚集，但不增加單核細胞的活化或體外遷移。

為進一步確定是什麼因素加重了動脈粥樣硬化的發展，研究者將巨噬細胞、平滑肌細胞、膠原蛋白、T細胞和所有中間型Ⅲ型病變。研究者發現，在控制病變嚴重程度的差異後，發現LD-DL組病變區域巨噬細胞和單核細胞數量增多，而SMC無明顯差異。並且，與巨噬細胞相比，膠原蛋白呈現出相反的變化趨勢，可能與病變區域金屬蛋白酶增多有關。

接下來，研究者為評估病變區域增加的單核細胞是否是迴圈中單核細胞增多的結果。研究者將第十週的小鼠處死，觀察早期動脈粥樣硬化病變組織中炎症細胞聚集情況，發現LD-DL組小鼠總的迴圈中單核細胞、Th細胞、Tc細胞和B細胞數均無明顯變化。為進一步評估ZT0和ZT12的單核細胞亞群情況及啟用狀態，研究者觀察到ZT0和ZT12處單核細胞數量相同，而在LD-DL組的小鼠在ZT0處T細胞數量增加，並且LD-DL組骨髓中的單核細胞前體確實表現出更多的促炎表型（即更多的經典單核細胞和中間單核細胞），但在迴圈中，只有微量的中間型單核細胞增加。為進一步確定單核細胞是否更具活性，研究者檢測了CD18、CD11a和CD62L的表達水平，與LD組相比，LD-DL組小鼠骨髓中表達並未增加，並且經過10周光暗交替後，PBMCs（由淋巴細胞和單核細胞組成）的體外遷移也沒有明顯增加。

三、週期性光暗變換會加重血管壁炎症反應，並且增加趨化因子CCL2的表達。

由於單核細胞本身的遷移能力沒有增加，因此研究者評估血管壁的變化是否可能是動脈粥樣硬化病變中單核細胞浸潤和巨噬細胞含量增加的原因。因此研究者檢驗了血管壁內驗證標誌物、氧化應激標誌物和白細胞募集標誌物的基因表達，發現LD-DL組小鼠在ZT0處驗證標誌物、氧化應激的表達增加，並且白細胞黏附分子Icam1、Vcam1和趨化受體Ccr2的表達在ZT0處也增加。表明，在光暗週期交替的環境下的小鼠的血管壁的炎症反應更加明顯，且表達更多的趨化表型。

但這些變化可能只是由ZT24到ZT0時期轉變的峰值期引起的，因此研究者透過評估干預15周後動脈粥樣硬化病灶內蛋白表達情況與巨噬細胞進行相關性分析來證實這一發現。ICAM-1和CCL2的免疫熒光雙染色顯示，LD-DL組的小鼠ICAM‐1的含量與病變中巨噬細胞的含量呈正相關，並且CCL2在LD - DL小鼠的III型病變中顯著增加，並與LD - DL組病變區域的巨噬細胞區域密切相關。同時透過免疫組化染色發現，LD-DL組小鼠氧化應激基因水平明顯高於LD組。

討論

本研究證實了週期性明暗交替破壞晝夜節律會導致白細胞隨之交替性發生變化，從而與晝夜節律不匹配，進一步導致免疫細胞功能改變。透過進一步實驗發現，內細胞中的分子生物鐘的紊亂可以直接導致ICAM-1和VCAM-1的表達增加，從而導致血管壁中單核細胞增多，引起炎症反應和氧化應激。此外，本研究也證實透過週期性明暗交替處理後的小鼠的動脈粥樣硬化病變中CCL2蛋白表達增加，雖然並沒有觀察到CCL2基因表達的顯著差異。

綜上所述，本研究首次證明了光暗週期變化直接促進動脈粥樣硬化的發展，在機制上，研究者發現晝夜節律的破壞可以導致內皮功能失調，細胞因子、趨化因子和粘附分子的表達增加。這些改變可能導致單核細胞從迴圈中遷移到動脈粥樣硬化病變中，從而增加病變中巨噬細胞的含量。

審校及組稿：上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院血管外科 楊碩菲醫師

編輯：血管資訊 Oliver