導言
視網膜色素上皮（RPE）具有許多對正常視網膜健康和功能至關重要的功能［1］。RPE作為感光細胞和脈絡膜血供之間的生理屏障，在保護視網膜免受系統性損傷方面發揮著重要作用，透過調節免疫反應，從而限制感染性或其他有害因素進入視網膜［1］。此外，更重要的是，RPE有助於將從脈絡膜血液中提取的營養物質和離子輸送到光感受器，並使光感受器產生的廢物逆向運動
老化
脈絡膜的分佈［2］。因此，RPE的損傷或功能障礙可能對依賴RPE的光感受器的健康和功能產生多米諾效應，從而對視覺功能產生重大影響。因此，RPE直接和顯著地參與大多數視網膜退行性疾病的發病機制並不奇怪，包括年齡相關性黃斑變性（AMD），這是全世界60歲及以上人群致盲的主要原因［3，4］。
AMD是一種複雜的多因素疾病，顧名思義，年齡是其發展的主要危險因素［5］。RPE主要受AMD的影響［6］。然而，有趣的是，大多數可用的實驗模型和相關研究，包括我們自己的先前研究，都更側重於識別、理解和限制老化和相關RPE功能障礙的繼發後果（例如，氧化應激增加、炎症，改變膽固醇代謝）而不是直接針對在細胞水平加速衰老的因素，如能量缺乏。後者的結果是體內平衡過程中的不平衡和隨後的損傷，如許多特定細胞型別所示。這是許多最近研究的前提，包括目前的研究，我們集中在煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和影響其生物利用度的因素與RPE活力的總體影響。
NAD+是一種中樞代謝輔助因子，在調節細胞代謝和能量穩態中起著關鍵作用［7，8］。NAD+與NADH（氧化為還原的NAD+）的比率調節各種代謝途徑所必需的酶的活性，包括糖酵解、Kreb迴圈和脂肪酸氧化［8］。有大量的臨床和實驗資料來源於對其他衰老原發性疾病（如阿爾茨海默病，2型糖尿病，非酒精性脂肪肝，等）表明，隨著年齡的增長，NAD+的利用率普遍下降，許多下游代謝途徑的活性降低，這些代謝途徑有助於退化過程的發展和進展［7，8］。神經細胞和組織在這方面似乎特別敏感。重要的是，上述研究還表明，透過促進NAD+的治療，年齡相關的退行性變過程可能被預防，或者至少其後果在嚴重程度上減輕。許多關鍵的NAD+依賴性蛋白（如sirtuin家族成員、聚ADP核糖聚合酶（PARPs）和環ADP核糖合成酶）的表達和活性以及能夠影響它們的治療的療效已經在老化視網膜和RPE的背景下進行了評估［9-11］。然而，對於調節NAD+生物合成的上游因子，尤其是RPE，關注甚少。鑑於視網膜色素上皮對視網膜健康和功能的重要性，在本研究中，我們著重於評估NAD+和調節其可用性的因素對視網膜色素上皮在體內和體外生存能力的影響。總的來說，我們的結果證實了NAD+對RPE健康的重要性，以及增強這種細胞型別中NAD+生成的治療對限制衰老和保持RPE活力的積極潛在影響。這一發現與AMD的臨床治療高度相關，但也可能與RPE受到顯著影響的其他退行性視網膜疾病的治療廣泛相關。
結果
NAD+水平隨著年齡的增長而下降
在許多細胞和組織型別中，NAD+水平隨著年齡的增長而下降［12，13］。同樣的情況是否發生在老化的RPE中尚不清楚。因此，我們的第一步是暫時評估活體動物RPE中NAD+的可用性。為了做到這一點，我們從C57BL/6J小鼠的眼睛中分離出RPE組織，按照正常實驗室小鼠的既定平均壽命（~24個月），這些小鼠屬於以下三個年齡組之一：青年（年齡1。5-6個月）、中年（年齡7-11個月）或老年（12個月或更大）。小鼠RPE中NAD+的水平與年齡呈負相關（圖1A）。NAD+水平在6個月齡時在該細胞層保持穩定，但此後不久開始顯著下降，因此到12個月齡時，RPE特異性NAD+含量平均下降40-50%。在從老年小鼠獲得的RPE中檢測到NAD+的進一步降低。
煙醯胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）是RPE中NAD+和下游SIRT1表達所必需的
為了確定我們在小鼠RPE中觀察到的NAD+水平的年齡依賴性下降的具體機制，我們接下來評估了與NAD+生物合成相關的酶的表達。在哺乳動物中，NAD+是透過兩種主要途徑之一產生的，從頭或補救途徑（［8，14］；圖1B）。與此一致，我們監測了煙醯胺腺苷酸轉移酶（NMNAT）、喹啉酸磷酸核糖轉移酶（QPRT）和煙醯胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）的表達，它們是與上述一條或兩條主要NAD+生成途徑相關的關鍵酶。NMNAT和QPRT在RPE中的表達保持不變
儘管與年齡相關的NAD+含量下降，但在所有受試年齡段中相對穩定（分別見圖1C和D）。然而，NAMPT表達（圖1E）與NAD+的年齡依賴性下降密切相關，強烈暗示該酶是RPE中驅動NAD+生成的主要酶。這一發現與現有科學文獻中的發現一致，這些文獻表明，哺乳動物在生理條件下產生的大部分NAD+來自補救途徑，也稱為脫醯胺途徑［14］。我們還評估了sirtuin家族成員1（SIRT1）的表達，SIRT1是一種高度研究的NAD+依賴性組蛋白脫乙醯酶，被吹捧為細胞能量代謝和應激反應的主要代謝感測器和調節器。
重要的是，SIRT1還與眼部老化和/或與年齡相關視網膜疾病的發展和進展相關的過程有關［15］。與NAD+和NAMPT mRNA表達一樣，隨著年齡的增長，小鼠RPE中SIRT1蛋白的水平顯著下降（圖1F）。此外，老化小鼠RPE中一些衰老相關標記物增加（圖S1）。
FK866抑制NAMPT從而降低NAD+水平並促進RPE衰老
到目前為止，我們的資料證實，隨著年齡的增長，RPE中NAD+水平下降。它們也證明了NAMPT對RPE中NAD+水平的產生和維持的關鍵重要性。因此，以NAMPT和NAD+為靶點的治療可能有助於保護視網膜色素上皮的健康和老年視網膜疾病（如AMD）的生存能力。然而，開發人員-
這一研究領域中新療法的開發和測試由於缺乏準確再現人類衰老和與年齡相關疾病特徵的實驗模型系統和/或生成可靠模型和進行此類研究所需的較長時間而受到嚴重阻礙。因此，為了進一步開展我們目前的研究，並評估NAMPT降低以及由此產生的NAD+可用性對RPE細胞活力的影響，我們使用高度特異性和非競爭性的NAMPT抑制劑FK866［16］來模擬培養的RPE細胞和完整小鼠視網膜中NAMPT表達和NAD+含量降低的年齡相關效應。
融合、分化良好的人RPE（ARPE-19）細胞培養物暴露於不同濃度的FK866中72小時。正如預期的那樣，FK866誘導NAD+水平呈劑量依賴性下降（圖2A）。細胞活力測定證實，由於FK866暴露在被測化合物的劑量範圍內（0。01–10μM；圖2B），因此沒有強大的細胞毒性。在用FK866處理的細胞中，β-半乳糖苷酶表達陽性的RPE細胞數量顯著且呈劑量依賴性增加，β-半乳糖苷酶是已建立的細胞衰老標記物（圖2C-D），這表明雖然該化合物沒有誘導強烈的細胞死亡，但另一方面卻刺激細胞衰老。為了證實這一點，我們還評估了細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑1（p21Waf/Cip1）、細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（p16INK4a）、載脂蛋白J（ApoJ）和結締組織生長因子（CTGF）的mRNA和/或蛋白表達，它們是衰老和細胞衰老的關鍵附加生物標記物［17-20］。與β-半乳糖苷酶染色一致，隨著FK866濃度的增加和NAD+濃度的下降，這些標記物的表達增加（圖3A-D）。此外，SIRT1的表達和活性呈劑量依賴性降低（圖4A-B）。
細胞衰老的一個常見後果是細胞處理氧化應激的能力下降，氧化應激是細胞新陳代謝的正常結果［21］。這會加劇炎症過程和進一步產生促氧化劑副產物。氧化應激和
炎症已被確定為是關鍵因素的影響
AMD和其他視網膜退行性疾病的發展和進展。因此，我們評估了FK866對白細胞介素6和8（分別為IL-6和IL-8）表達的影響，這兩種促炎細胞因子在退化性RPE中普遍升高［17，22］。在我們的實驗系統中，隨著FK866濃度的增加，IL-6和IL-8的水平增加（圖4C-D）。
根據我們之前的發現，10µM FK866的劑量被確認為最佳標準劑量。為了確定FK866處理的最佳潛伏期，用10μM FK866處理ARPE-19的額外培養物24、48或72小時，引數與上述引數相同（圖。2-4）進行評估。FK866能有效地降低NAD+水平，但是
在我們最初的研究中所用的72小時潛伏期（圖5A）中取得了最大的療效。在這些額外批次的細胞中重複進行細胞活力測定，並確認在所有測試時間點暴露於10µM FK866的細胞中沒有細胞毒性（圖5B）。β-半乳糖苷酶染色和相關定量顯示，在FK866處理的培養物中，β-半乳糖苷酶陽性細胞的數量隨時間而增加（圖5C-D）。同樣，p21Waf/Cip1、p16INK4a、ApoJ和CTGF的表達隨時間而增加（圖6A-D），SIRT1的表達和活性隨時間而降低（圖7A-B），進一步支援了72小時潛伏期的最佳性（圖6A-D）。
FK866誘導RPE炎症因子表達及ROS生成
衰老的細胞分泌大量的前體蛋白-
炎性細胞因子、趨化因子、生長因子
圖3。FK866誘導人視網膜色素上皮細胞衰老標誌物的變化。
用不同劑量（0。01～10μM）的FK866處理人視網膜色素上皮細胞（ARPE‐19），用qPCR和westernblotting檢測不同衰老指標的表達變化。顯示了（A）p21Waf/Cip1 mRNA，（B）p16INK4a和p21Waf/Cip1蛋白，（C‐D）CTGF和ApoJ mRNA水平的劑量依賴性變化。顯示了三個複製品的代表性westernblot影象。基因mRNA表達正常化為18s表達。資料表示為n=3個獨立實驗的平均值±S。E。M。*與CON（溶媒處理）相比p
圖4。FK866降低人視網膜色素上皮細胞SIRT-1的表達/活性並增加炎症反應。
人視網膜色素 上皮細胞（ARPE‐19）用不同劑量處理 （0。01‐10μM）的FK866和（AB）表達及（）活性 透過western印跡和免疫組化檢測SIRT1的表達 市售SIRT1檢測試劑盒。（光碟）炎症標誌物（IL-6和IL-8）的變化由qPCR評估。具有代表性的westernblot影象圖中顯示了三次複製的結果。基因mRNA表達
正常化為18s表達。資料表示為
n=3個獨立實驗的平均值±S。E。M。*p
與CON（溶媒處理）相比
圖5。用FK866處理的人視網膜色素上皮細胞中NAD+含量的時間依賴性下降和衰老的誘導。
人視網膜色素上皮細胞（ARPE‐19）被處理
用10μM FK866處理24、48和72小時。（A）NAD含量（B）細胞活力和（C-D）的時間依賴性變化+
對FK866處理的人RPE細胞的衰老進行了評價。對於n=3個獨立實驗，資料以平均值±S。E。M表示。*與對照組相比p
以及蛋白酶，舉例說明所謂的衰老相關分泌表型（SASP）［23］。此外，氧化應激在RPE衰老中也起著重要作用［24-26］。與此一致，我們用10µM FK866處理額外的ARPE-19細胞72小時，該劑量和時間點在降低NAD+和促進細胞衰老方面最有效，沒有強烈的毒性，並監測它們的促炎細胞因子IL-6和IL-8的表達（圖7C-D），以及CellROX和MitoSOX陽性，這是細胞凋亡的一般標誌物氧化應激和線粒體特異性超氧化物標記物（圖7E）。與IL-6和IL-8表達一樣，暴露於FK866的ARPE-19細胞中，與對照的未暴露細胞培養物相比，暴露於FK866的ARPE-19細胞中用CellROX或MitoSOX染料（分別為綠色熒光和紅色熒光）陽性染色且因此氧化應激量增加的細胞數增加
煙醯胺單核苷酸（NMN）處理可在體外保持NAD+並防止RPE衰老
增強NAD+的療法已被證明可降低年齡相關併發症的發生率和/或嚴重程度［27-31］。然而，目前尚不清楚後者是否也有利於老年視網膜色素變性和相關的視網膜變性疾病。到目前為止，我們的研究已經證實了老化RPE中NAMPT和相關NAD+利用率的下降，並驗證了FK866處理的細胞培養系統是研究這些因素的合適的體外模型系統。因此，我們利用這個實驗模型來確定使用NAD+前體煙醯胺單核苷酸（NMN）增加NAD+含量是否可以保護NAD+並防止FK866誘導的RPE衰老。NMN劑量依賴性地增強暴露於FK866的細胞中的NAD+水平（圖8A）。
圖6。FK866對人視網膜色素上皮細胞衰老標誌物的時間依賴性影響。
人視網膜色素上皮細胞（ARPE‐19）是用10μmFK866處理24、48和72小時。用qPCR和westernblotting檢測不同衰老指標的表達變化。時間相關的
Waf/Cip1 INK4a Waf/Cip1
圖中顯示了（A）p21mrna、（B）p16和p21蛋白、（C‐D）CTGF和ApoJ mRNA水平的變化。顯示了三個複製品的代表性westernblot影象。基因mRNA表達正常化為18s表達。資料表示為n=3個獨立實驗的平均值±S。E。M。*與CON（溶媒處理）相比p
圖7。人視網膜色素中SIRT-1表達/活性和炎症標記物的時間依賴性變化
FK866處理的上皮細胞。
用10μmFK866處理人視網膜色素上皮細胞（ARPE-19）24、48和72小時
人力資源部。（A）SIRT-1的表達和（B）活性分別透過western blotting和市售SIRT-1檢測試劑盒進行評估。（C‐D）透過qPCR評估炎症標記物（IL‐6和IL‐8）的變化。（E） CellROX和MitoSOX染色的10μM FK866處理（72小時）的代表性影象顯示了來自三個重複的代表性western印跡影象。基因mRNA表達正常化為18s表達。資料表示為n=3個獨立實驗的平均值±S。E。M。*與對照組相比p
CON（車輛處理）。
此外，該化合物透過抑制p16INK4a和p21Waf/Cip1表達以及減少SIRT1表達（圖8B）來阻止FK866誘導的RPE衰老。在暴露於NMN的培養物中，β-半乳糖苷酶陽性細胞的數量也減少（圖8C-D）。
ARPE-19雖然起源於人類，但卻是一種“轉化”的視網膜細胞系。因此，為了驗證使用ARPE-19細胞培養獲得的結果，使用原代小鼠RPE培養物重複關鍵實驗（圖9）。FK866可有效降低原發性RPE中NAD+的表達，儘管細胞活力資料表明細胞毒性形式的敏感性增加（圖9A）。因此，在隨後使用這些細胞的研究中，我們避免使用更高劑量的化合物（圖9B-G）。如在ARPE-19細胞中所觀察到的，RPE細胞暴露於FK866可增強細胞衰老（圖9C），並且這些現象被細胞與NMN的共同暴露所抑制（圖9D-F）。重要的是，NMN還阻止了FK866誘導的SIRT1表達減少（圖9G）。
煙醯胺單核苷酸（NMN）處理在體內保持NAD+並防止RPE衰老
為了確定我們在ARPE-19和原代RPE細胞培養模型系統中的發現是否可以外推到活體動物身上，我們將FK866視網膜下注射到成年C57BL/6J小鼠的眼睛和/或腹腔注射NMN。從注射FK866的小鼠分離的RPE組織中NAD+水平顯著低於注射溶媒（PBS）的對照組（圖10A）。另一方面，僅注射NMN後，NAD+水平增加了一倍以上，在接受NMN聯合FK866治療的動物中，NAD+水平顯著保持。結合NMN注射，SIRT1表達被額外保留（圖10B）。
討論
視網膜色素上皮具有多種多樣的功能，對維持視網膜的正常健康和功能至關重要。因此，這一細胞層的功能障礙與許多視網膜退行性疾病的發生和發展有因果關係並不奇怪。細胞衰老是衰老的一個常見後果，因此，我們觀察到的RPE中NAD+的下降和衰老標誌物的相關上調錶達並不完全令人驚訝。儘管有一些爭論是否功能障礙首先發生在視網膜色素上皮或其上覆的光感受器，衰老相關的視網膜色素上皮損傷對年齡相關的視網膜色素上皮功能障礙的貢獻是不可否認的。不管對引起老化外視網膜退化過程的事件的確切時間順序的看法如何，儲存健康視網膜色素上皮的重要性被強調為，據我們所知，沒有任何實驗或臨床條件下，感光細胞在視網膜色素上皮的下伏區域上方持續不受影響損壞、功能失調或死亡。這是一個例子，嚴重不可逆轉的喪失中央視力，可以
發生在與地理萎縮或RPE細胞脫落的晚期乾性AMD。因此，瞭解視網膜色素上皮年齡相關性改變的機制對於有效預防和治療老年性視網膜變性疾病（如AMD）的治療方法的發展是非常重要和必要的。對於乾燥型疾病尤其如此，它（a）通常首先出現，（b）影響最大數量的患者，以及（c）不太適合目前可用的任何形式的治療管理［32-34］。考慮到這些事實，在本研究中，我們將重點放在NAD+。
在許多細胞和組織型別中，NAD+水平隨著年齡的增長而下降。事實上，NAD+代謝的改變和線粒體功能的同時改變是代謝紊亂（包括2型糖尿病、非酒精性脂肪肝和年齡相關疾病，如帕金森病和阿爾茨海默病）所固有的［7］。
圖8。煙醯胺單核苷酸（NMN）治療可保護人視網膜色素上皮細胞NAD+並防止其衰老。
用10μmFK866單獨或聯合不同劑量的NMN（0。05-1mM）處理人視網膜色素上皮細胞（ARPE-19）72小時。（A） NAD+含量用NAD試劑盒測定。（B） 免疫印跡法檢測SIRT1、p16INK4a和p21Waf/Cip1蛋白表達水平的變化。（C‐D）透過β-半乳糖苷酶染色評估RPE衰老。顯示了三個複製品的代表性westernblot影象。資料以平均值±S。E。M表示，n=3
實驗。*與CON（溶媒處理）相比p
圖9。煙醯胺單核苷酸（NMN）處理可保護小鼠視網膜色素上皮細胞NAD+並防止其衰老。
原代RPE細胞從17日齡小鼠幼崽中分離並按材料和方法進行培養。用不同劑量的FK866處理小鼠原代RPE細胞5天，觀察細胞活力、NAD+含量、衰老和SIRT1表達的變化。（A） MTT法檢測細胞活力。（B和D）使用NAD分析試劑盒測量NAD+含量。（C，E和F）RPE衰老透過β-半乳糖苷酶染色進行評估。（G） 透過westernblotting評估SIRT-1蛋白表達水平的變化。顯示了三個複製品的代表性westernblot影象。資料表示為n=3個獨立實驗的平均值±S。E。M。*與CON（溶媒處理）相比p
圖10。體內施用煙醯胺單核苷酸（NMN）可防止FK866誘導的NAD+耗竭和RPE衰老。
外螺紋C57BL/6J 小鼠視網膜下注射10μM FK866（右） 第0天和第7天，第15天（7天）處死 最後一劑後）。然後收集RPE/眼罩進行檢查 進一步分析。同時，給小鼠進行藥物治療 150mg/kg NMN（i。p。），持續14天。左眼注射 以PBS作為對照。（AB）NAD+含量和（）
SIRT-1的表達透過NAD分析和
免疫印跡法。具有代表性的西方
顯示了三個複製品的印跡影象。資料是
表示為n=5的平均值±S。E。M。*與CON（溶媒處理）相比p
此外，增強NAD+產生和/或下游NAD+依賴酶的表達和活性的療法在治療此類疾病方面顯示出益處［35］。特別是在視網膜中，NAD+在正常和衰老中的重要性已經在光感受器中直接評估［36］，但尚未在潛在的視網膜色素上皮中進行廣泛研究。這既有趣又不幸，因為如前所述，視網膜色素上皮（RPE）具有許多重要的主要功能和支援功能，因此，存在於光感受器和視網膜色素上皮（這兩種細胞型別主要受AMD影響）之間的強制性共生關係。最近的一份報告［37］證明，使用從有或沒有AMD的供體制備的人類誘導多能幹細胞源性RPE細胞（hiPSC-RPE），NAD+前體煙醯胺在限制與drusen發育和AMD直接相關的關鍵補體和炎症蛋白表達方面的益處。這項研究支援了以NAD+生物合成為靶點的治療方法的可行性，以維持RPE的活性，從而預防和/或治療老年視網膜的相關退行性變過程。
在這裡，使用成年C57BL/6J小鼠，年齡範圍很廣（2-18個月），其中沒有任何潛在的rd突變，可能對視網膜表型或功能產生不利影響已經得到證實［38］，我們首先證實，NAD+水平隨著年齡的增長而顯著下降，這在其他視網膜和非視網膜細胞型別中也有報道。作為陽性對照，我們還監測了SIRT1的表達，SIRT1是一種下游的NAD+依賴酶，已知其表達隨著年齡的增加而降低，並且在各種生物體、細胞和組織型別中NAD+的可用性降低。我們對NAD+生物合成關鍵步驟的酶的相關評估顯示，NAMPT主要負責維持RPE中足夠的NAD+水平。這與其他人最近的研究一致，他們證明NAMPT介導的NAD+生物合成對正常視覺功能至關重要［36］。
AMD研究中的一個主要限制因素是缺乏準確模擬疾病發病過程的急性實驗模型，同時提供一個可靠的臨床前系統來快速測試發育療法。FK866已廣泛應用於癌症領域和其他領域，用於研究NAMPT抑制對各種過程的影響，包括細胞活力和免疫訊號、炎症和能量代謝［16、39、40］。在這裡，我們使用該化合物來最佳化細胞培養模型系統，該系統允許我們模擬和研究NAMPT表達降低和相關NAD+可用性對與衰老相關的RPE細胞活力的影響。我們對人RPE細胞系ARPE-19的研究表明，透過分析β-半乳糖苷酶、ApoJ、p16INK4a、p21Waf/Cip1和CTGF等衰老標記物的表達，RPE細胞衰老增加，NAMPT和NAD+利用率降低。重要的是，細胞與NAD+前體NMN的共同暴露穩定了NAD+和SIRT1的水平，即使在NAMPT抑制的情況下，也阻止了衰老相關基因表達的誘導。ARPE-19是一個轉化細胞系，我們用FK866人工模擬了這些細胞中NAD+的年齡相關性下降。因此，我們承認這些細胞的反應方式與天然RPE可能存在差異。為了減輕這種擔憂，我們在原代小鼠RPE細胞中重複了關鍵實驗。分離培養小鼠原代RPE的最適年齡為18～21天。細胞可以從年齡較大的老鼠身上分離出來，但在培養過程中不能很好地持續很長時間。這使得從年輕和老年小鼠獲得的原代RPE細胞之間的直接比較研究難以標準化。因此，我們再次使用FK866抑制從年輕小鼠分離的原代RPE細胞中的NAMPT活性。重要的是，我們的細胞培養模型系統和資料的有效性得到了以下事實的有力支援：在我們的細胞培養中獲得的結果與從活體動物眼睛獲得和分析的完整RPE組織獲得的結果非常相似。
隨著年齡的增長，眼內外疾病形成的風險和發生率成比例增加。儘管不同疾病的細胞和組織型別可能不同，但衰老過程和老年性退行性疾病的發展通常涉及細胞能量生產的進行性下降，從而導致細胞活力和功能的下降。視網膜等神經組織尤其敏感。在AMD中，光感受器和RPE都發生逐漸的退行性改變。RPE衰老被認為是促成這些變化的主要原因［41-43］。一些關於防止RPE衰老相關變化和潛在影響AMD發展的前景已經透過實驗證明，使用諸如白藜蘆醇之類的化合物可以影響SIRT1的表達和活性，SIRT1是一種下游NAD+依賴基因，反過來，控制維持細胞活力所必需的過程［44-46］。然而，很少有人直接探討靶向NAMPT和NAD+生物合成本身的潛在治療效果，儘管NAD+是大多數主要代謝途徑的起點，因此是細胞衰老和年齡相關過程的關鍵調控者。
我們目前的資料顯示NAMPT表達的年齡依賴性下降，反過來，RPE中NAD+的生成最終促進了RPE的衰老，這有力地支援了在治療上增強NAMPT表達和相關NAD+生成的理論基礎。事實上，這種療法可能代表了一種可行的策略，用於預防和治療視網膜色素上皮和隨後的光感受器損傷在衰老/AMD中，以及廣泛地，在視網膜色素上皮受到顯著影響的其他退行性視網膜疾病中。AMD是全球60歲及以上人群致盲的主要原因［47，48］。與醫療保健的進步和“嬰兒潮一代”的大量出現相一致，這個年齡段內的人數已經並將繼續穩步大幅增加，AMD的發病率與之成比例。事實上，據估計，到2020年，將有2億人受到AMD的影響［48］。因此，AMD代表著當前和未來全球健康和經濟的重大負擔［49］，由於缺乏預防和治療乾性AMD的策略，其影響更加嚴重，乾性AMD是最常見的疾病形式，因此影響到最多的患者。基於我們目前的實驗觀察，未來的臨床前研究評估NMN或其他療法在老化和年齡相關視網膜疾病發展和進展的背景下對NAMPT表達和NAD+代謝有直接影響是非常有必要的。
材料和方法
動物
所有涉及動物的實驗均遵守《公共衛生服務政策關於實驗動物的人文關懷和使用》（2015年衛生、教育和福利部出版物，NIH 80-23），視覺和眼科研究協會關於在眼科和視覺研究中使用動物的宣告，並由奧古斯塔大學機構動物護理和使用委員會批准。不同年齡組的雄性C57BL/6J小鼠來自商業供應商（Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME，USA）和國家老齡化研究所（National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA），在相同條件下飼養在無病原體的環境中，光/暗迴圈時間為12：12小時，可自由進入實驗室食物和食物水。小鼠在實驗前至少適應了1周。
細胞培養
人視網膜色素上皮（ARPE-19）細胞在Dulbecco改良的Eagle培養基DMEM/F12培養基（新增10%胎牛血清、100 U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素）中培養，並在含5%CO2的加溼室中維持在37°C。每隔一天用新鮮培養基代替培養基。培養物在0。05%（w/v）胰蛋白酶磷酸鹽緩衝液（PBS；0。01m磷酸鹽緩衝液，0。0027mkcl，0。137mnacl，ph7。4）中解離傳代。
完全融合，分化良好的培養物用於實驗。
從C57BL/6J小鼠眼睛製備原代小鼠RPE細胞，並根據我們公佈的方法確認這些培養物的純度［50-53］。然後將原代小鼠RPE細胞保持在37°C、含5%CO2的加溼室內，並使用胰蛋白酶-EDTA溶液傳代培養。所有實驗均在第1代和第2代用原代RPE細胞進行。
逆轉錄-定量聚合酶鏈反應
用rneasy-mini試劑盒（Qiagen，USA）從2、12和18個月大的小鼠RPE/眼杯或ARPE-19細胞中分離總RNA。用iScript-cDNA合成試劑盒（Bio-Rad）從總RNA中製備cDNA，並進行qPCR分析。在96孔PCR平板上使用All-in-One進行檢測™ qPCR混合物（Genecopia，美國）。反應體積為20μl，含10。0μl SYBR綠色主混合物（2X）、1μl cDNA、1μl每個引物和7μl無核酸酶水。引物序列列於表1。使用以下兩步熱迴圈曲線（StepOnePlus實時PCR，紐約州格蘭德島生命技術公司）：第一步（迴圈）：95°C 5分鐘，95°C 15秒，60°C 30秒和72°C 15秒，40個迴圈。第二步（熔融曲線）：60℃15s，60℃1min，95℃30s，透過熔融曲線分析確認模板擴增。基因的mRNA表達標準化為18s表達，並透過2∆∆Ct法計算表達的倍數變化。
FK866和煙醯胺單核苷酸（NMN）治療
將ARPE-19細胞血清飢餓過夜，用不同劑量（0。01-10μM）的FK866（Sigma-Aldrich）處理不同時間間隔（24、48或72h）。在FK866治療後，收集細胞用於以下一種或多種分析：MTT分析、NAD+測定、SIRT1活性分析、RNA或蛋白質研究。原代小鼠RPE細胞的處理和分析方法相似，但採用低劑量的FK866（0。01、0。1和0。5μM）。透過以上實驗，建立了最佳工藝條件
表1。
用於qPCR的引物序列。
使用FK866充分抑制NAMPT的劑量和時間，而不會對ARPE-19和原代RPE細胞產生強烈的細胞毒性。與這些研究一致，ARPE-19和原代小鼠RPE細胞培養物在存在或不存在不同濃度的NAD+前體煙醯胺單核苷酸（NMN；0。05–1。0 mM）的情況下暴露於FK866（10μM）72 h。
對於體內研究，成年雄性C57BL/6J小鼠透過單次腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和甲苯噻嗪（12 mg/kg；SigmaAldrich，St。Louis，MO，USA）被深度麻醉。在透過腳趾夾確認麻醉深度後，在第0天和第7天使用33號漢密爾頓注射器（漢密爾頓，雷諾，內華達州，美國）將FK866（10μM）以2μL的總體積注入視網膜下。假對照眼（左眼）除注射2μL 0。01M PBS外，其餘均以相同方式注射。一組注射FK866的小鼠接受150mg/kg NMN（i。p。）治療，每天一次，持續2周［36］。第二次注射FK866一週後處死小鼠，採集RPE組織進行NAD+測定和蛋白質分析。
蛋白質印跡分析
使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解緩衝液（Thermo Scientific）從小鼠（2、12和18個月大）的RPE/眼杯或ARPE-19細胞或原代RPE細胞中提取蛋白質，並使用考馬斯蛋白質分析試劑（Sigma-Aldrich，USA）測定濃度。將等量的蛋白質樣品進行SDS-PAGE，轉移到PVDF膜上，然後與一級抗體：SIRT-1、p21Waf/Cip1（1：1000；細胞訊號）和p16INK4a（1：500；Abcam）在4℃下培養過夜。第二天，用TBST洗滌印跡，並與辣根過氧化物酶結合的二級抗體（1：3000；Sigma-Aldrich，USA）在室溫下輕輕搖動孵育60分鐘。然後用化學發光試劑（Bio-Rad，Hercules，CA）用放射自顯影膠片（Genesee）沖洗（TBST）和顯影斑點
科學，聖地亞哥，加利福尼亞州）。評估β-肌動蛋白（1：3000；SigmaAldrich，USA）的表達以確定等效負荷。用NIH-ImageJ軟體對蛋白表達進行定量分析（http：//rsb。info。nih。gov/ij/）。
NAD+測定
根據製造商的說明，使用市售試劑盒（Sigma，MO，美國）對細胞和組織中的NAD+水平進行定量。
SIRT1活性測定
根據製造商的方案，使用熒光SIRT1分析試劑盒（Sigma-Aldrich，美國）在ARPE-19細胞中進行SIRT-1脫乙醯酶分析。簡言之，反應在37℃下進行30分鐘，並且使用360 nm的激發波長在450 nm處以熒光發射檢測脫乙醯酶活性。從最初測定的測定值中減去化合物在450 nm處發出的熒光強度。
β-半乳糖苷酶測定
根據製造商的方案（細胞訊號技術）進行衰老相關β-半乳糖苷酶（β-Gal）染色。在治療結束時，細胞在1x固定液（甲醛-戊二醛混合物）中固定15分鐘，然後用PBS洗滌，並在37℃的乾燥培養箱中用β-半乳糖染色液培養過夜。在布萊特菲爾德顯微鏡（Leica BM5500B顯微鏡；Leica Biosystems，Wetzlar，德國）下觀察細胞的藍色使用photommetrics CoolSNAP HQ2相機和相關的Leica應用程式套件軟體v4。1進行開發和拍攝。
CellROX和MitoSOX染色
用10μmfk866處理ARPE-19細胞72小時。如上所述。在處理結束時，將細胞與5μM CellROX孵育30分鐘或5μM MitoSOX孵育10分鐘。在孵育結束時，用PBS洗滌細胞，用帶有DAPI的熒光遮蔽固定培養基固定，並用蔡司Axioplan-2成像熒光顯微鏡拍攝影象。
統計分析
至少三個獨立實驗的結果以平均值±S。E。M表示。統計顯著性定義為p
作者貢獻
構思和設計實驗：RNJ，PMM；進行實驗：RNJ，FLP，MAJ，JF，EJ，MCT；分析資料：RNJ，MB，PMM；撰寫手稿：RNJ，PMM。
致謝
作者感謝江河源對視網膜下注射的幫助。
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