自然雜誌新文章揭示
腫瘤液體活檢“難以精準”的真相
近期，《自然》發表了一篇學術研究文章，對來自5個供體的9個器官的1737個形態正常的組織活檢進行了全面的基因組分析。研究發現，在形態正常的人體組織中，儘管程度不同，體細胞突變積累和克隆擴增廣泛存在，同時也包含與腫瘤相關的大量突變［1］。
早在在2019年《科學》的一篇文章，來自美國哈佛-麻省理工的博德研究所的GadGetz教授研究團隊，首次對人體不同組織中正常細胞的突變進行了全面綜合的分析，同樣發現在正常組織中不同程度地檢測到了攜帶體細胞突變的遺傳克隆，其中一些竟然攜帶有癌症相關突變［2］。
同年的《自然》子刊發現癌症患者血液中大部分突變不是來自於癌細胞。MSKCC團隊發現，癌症患者血液中一半以上的突變來自於白細胞［3］。這些發現有助於我們更好地理解癌症。
其實在這幾項研究之前，科學家們就已經認識到健康的組織裡也有很多突變，甚至是和癌症相關的突變，但這些突變並不總會驅動癌症的發生。研究人員們指出，這可能僅僅是因為這些突變是癌細胞從健康細胞裡遺傳來的，不代表它們就真的會引起癌症。
這些研究結果提示我們，目前以ctDNA為研究核心的液體活檢高通量測序技術，很難突破複雜的背景噪音以及ctDNA來源問題的“困境”，在實際臨床應用中還需要更有效的技術方法！
液體活檢現有
臨床檢驗技術平臺均存在短板
腫瘤液體活檢的概念已經提出了多年，其中迴圈腫瘤細胞（CTC）和迴圈腫瘤DNA（ctDNA）是目前腫瘤精準醫學應用研究的熱點與重點。ctDNA是由腫瘤細胞壞死、凋亡或者正常分泌到血液中DNA片段，其攜帶了腫瘤相關的基因變異資訊；CTC是從腫瘤原發灶或轉移灶進入血液的腫瘤細胞，其包含了完整細胞所攜帶的全部資訊，包括腫瘤相關蛋白的表達量、染色體變異水平、腫瘤基因突變等。
雖然ctDNA檢測目前主要應用於靶向藥物基因檢測以及療效耐藥監測中，但是除了上述研究中存在的不可避免的來源問題，在臨床實際應用中也面臨著諸多問題，比如：含量稀少、NGS靈敏度不夠、臨床指導意義不強、成本價格昂貴等。
而在臨床應用多年的CTC在相關檢測技術方面也難以突破，靈敏度和特異性還有待進一步提高。臨床對於目前技術所捕獲的細胞是否是腫瘤細胞，尚有存疑。同時臨床應用停留在計數階段，難以擺脫“雞肋”的尷尬地位。
目前已進入臨床應用的
腫瘤液體活檢技術平臺
從上表中我們可以看到，目前熒光PCR和NGS（二代高通量測序）的靈敏度都難以滿足腫瘤液體活檢對技術平臺檢出限的要求。數字PCR是目前大家都比較看好的液體活檢技術平臺，與相對定量的熒光PCR相比，其優勢在於可以將一份標本透過液滴技術分割成幾萬甚至幾十萬個“獨立的微滴單元”，從而對目標核酸片段（DNA）進行絕對定量的檢測分析。
與NGS檢測液體標本靈敏度偏低、費用昂貴且檢測週期較長相比，數字PCR具有“檢測結果更精準、費用便宜近一半、當天可出結果”的巨大優勢，特別是針對腫瘤液體活檢中的低丰度基因突變檢測、融合基因檢測、乳腺癌分期、甲基化分析、單細胞基因表達分析、微小殘留病灶檢測和外周血microRNA絕對定量方面，數字PCR的優勢十分明顯，但是隻具有檢測更精準優勢的數字PCR仍然解決不了“如何甄別來源於非癌細胞的基因突變”問題！
全球首款採用微針列印技術的晶準無芯式數字PCR
創新“最佳拍檔”
或成液體活檢破局關鍵
來自香港城市大學生物醫學系的科研團隊認為，液體活檢在癌症篩查和早期檢測的應用，必須是多維度標誌物（蛋白/基因/細胞）和多組學層面的結合，單一類的腫瘤標誌物（如蛋白標誌物或ctDNA突變或DNA甲基化）在靈敏度和特異性方面有很大的侷限性。
要提高腫瘤早期篩查和診斷的準確性，必須把CTC作為核心資訊源（完整的腫瘤細胞）與其他腫瘤標誌物相結合。
近年來，他們利用慣性聚焦法微流控CTC分選技術和高通量單細胞測序技術，建立了多種癌症的CTC單細胞全基因組的資料庫，為CTC與ctDNA及其他標誌物的聯合使用奠定了理論和實驗資料基礎。
採用慣性聚焦微流控晶片的CTC平臺，可以無損捕獲CTC，能最大程度的保持細胞完整性和活性，且靈敏度和特異性均達95%以上。
針對腫瘤液體活檢單一檢測平臺面臨的技術困境，該團隊率先提出了“基於CTC的多重生物資訊鑑定結合靶基因突變檢測”的互證式檢驗策略，採用“CTC+數字PCR”的雙平臺聯合檢測方案，不但破解了目前基於血液樣本的ctDNA檢測技術的來源問題“困局”，還可以在基因層面印證細胞的腫瘤來源，併為臨床提供更有針對性的用藥指導資訊。
在患者無法取得組織標本（或組織標本比較早期）的情況下，該方案可以同步獲得腫瘤的動態監測、PD-L1免疫治療和靶向用藥資料，為患者和臨床醫生提供了一個更完整、更精準的腫瘤液體活檢解決方案，非常適合現有的PCR實驗室開展針對腫瘤液體活檢的臨床檢驗業務。
腫瘤動態監測+PD-L1免疫治療檢測
基於CTC細胞的靶向基因檢測
今年上半年，該團隊採用CTC 100技術平臺，配合江蘇省某三甲醫院在國內首次針對第三代微流控CTC平臺做了近五個月的對比測試，嘗試驗證目前國內最先進的幾個CTC平臺是否可以真正實現這些目標：
1。透過準確的CTC計數分型實現精準的腫瘤動態監測；
2。透過基於CTC的PD-L1蛋白檢測輔助診斷腫瘤免疫治療；
3。透過捕獲具有活性的完整腫瘤細胞開展下游基因檢測；
4。細胞培養
結果驚喜發現採用慣性聚焦法的微流控CTC分選平臺，不但可以捕獲具有活性的完整迴圈腫瘤細胞，而且24小時腫瘤細胞活率達到了83％。而且基於CTC上的PD-L1檢測與金標準的符合率達到了95%以上。
據悉，來自香港城市大學生物醫學系的科研團隊多年前已經開展了CTC單細胞基於數字PCR技術的腫瘤靶向基因檢測（EGFR、KRAS、NRAS等）可行性驗證，發現在保證CTC單細胞捕獲質量的前提下，靶藥基因的檢測結果與臨床金標準也非常接近。
相信隨著越來越多臨床資料的驗證，“CTC+數字PCR”這一創新的雙平臺聯檢方案，非常有希望突破目前大多數單一腫瘤液體活檢平臺面臨的技術瓶頸，成為腫瘤精準醫學中心開展腫瘤液體活檢的“最佳拍檔”，為腫瘤液體活檢多年無解的技術困境提供了一個全新的突破思路。
參考文獻：
［2］YizhakK， Aguet F， et al。 RNA sequence analysis reveals macroscopic somaticclonal expansion across normal tissues。 Science。 2019 Jun7；364（6444）：eaaw0726。 doi： 10。1126/science。aaw0726。
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