人口老齡化是世界各國十分關注的話題。僅在美國，預計到2050年，65歲或65歲以上的人口將達到近8300萬，佔世界人口的20%以上人口老齡化是多種生理機能的衰退，導致各種組織和器官失去健壯性，最終增加對各種侮辱的脆弱性和對許多不同疾病的易感性。中樞神經系統不能免疫衰老的影響。在美國，71歲以上的人中有22%出現認知障礙國家。平等像焦慮症這樣的精神障礙也很普遍，佔老年人的10-20%，比痴呆症或抑鬱症更常見精神障礙焦慮症患者90%被認為是廣泛性焦慮精神障礙（GAD）或特定的恐懼症，GAD佔50%案子。遲了-生活焦慮症不僅給個人，也給整個醫療體系帶來了巨大的經濟負擔。隨著人口老齡化的不斷加劇，解決這些問題、提供有意義的福利和提高生活質量已成為一個越來越重要的問題。1 2 3 4，5

煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）是氧化還原反應的經典輔酶，也是NAD+消耗酶的底物，其維持對多種組織和器官的強大功能至關重要，這已成為共識。                                                                                                                               +

然而，在衰老過程中，多個外周組織和大腦，特別是海馬體的NAD水平下降很明顯。這個衰老過程中NAD+水平的系統性降低部分是由於煙醯胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）的降低，後者是NAD+生物合成途徑中的限速酶在哺乳動物。那裡是合成NAD+的五種主要前體：色氨酸、煙醯胺和煙酸（兩種維生素B3）、煙醯胺核糖和煙醯胺單核苷酸。其中，煙醯胺是哺乳動物NAD+生物合成的主要前體，透過NAMPT轉化為關鍵的NAD+中間體煙醯胺單核苷酸（NMN）。煙醯胺/煙酸單核苷酸腺苷酸轉移酶（NMNATs）將NMN轉化為NAD+。事實上，已經證明，12個月的NMN補充可有效緩解正常B6小鼠的多種年齡相關功能衰退，提示NMN可能作為一種預防和治療抗衰老的干預手段。

圖1老年小鼠海馬NAD+水平顯著降低，但仍保持空間獲得和學習能力。2、7和19月齡雄性小鼠海馬NAD+水平（n=6；*p

許多酶，包括聚ADP核糖聚合酶、sirtuins和CD38/CD157胞外酶，依賴於整個身體內NAD+的持續供應。Sirtuins是一類NAD+依賴的脫乙醯基酶/脫乙醯基酶，在將營養訊號整合到各種生理反應中起著核心作用。Sirtuins調節許多重要的生物過程，包括新陳代謝、應激反應、DNA修復、染色質重塑、晝夜節律和細胞週期變老了。那裡是七種哺乳動物sirtuins，SIRT1–7，其中一些已被報道在哺乳動物大腦中發揮重要作用。例如，SIRT1已被證明能調節長時程增強和學習記憶記憶體。SIRT1同時促進阿爾茨海默病和亨廷頓病小鼠模型的認知功能疾病。我們研究還表明SIRT1和SIRT2對促進少突膠質細胞向神經幹/祖細胞分化很重要細胞。有趣的是，兩者SIRT1和SIRT2也與抑鬱症有關

行為。

我們先前的研究已經證明，前腦興奮性神經元的NAMPT對於認知和行為的發展至關重要函式。In在這些研究中，我們使用前腦興奮性神經元缺乏Nampt的小鼠（CaMKIIαNampt−小鼠）。儘管這些小鼠表現出顯著的表型，證明了NAMPT在海馬認知功能中的重要性，但很難知道NAMPT介導的NAD+生物合成是否確實有助於海馬認知功能的年齡相關變化。因此，我們決定評估年輕小鼠和老年小鼠在認知和行為功能方面的差異。然後，我們檢測海馬區域特異性Nampt基因敲除是否能重現老年小鼠的認知表型。我們在這項研究中的發現為NAMPT介導的NAD+生物合成在年齡相關性海馬認知功能下降中的重要性提供了新的線索。17，20

結果

補充NMN可改善老年小鼠的認知超敏反應

目前已經證實，NAD+水平下降，在多個組織和器官的過程中老化在海馬體，我們能夠證實類似的NAD+下降（圖1a）。比較2個月、7個月和19個月大的海馬NAD+水平，我們觀察到NAD+逐漸減少約40%（圖1a）。為了檢查是否有任何認知和行為損傷與NAD+減少有關，我們對2個月齡和20個月齡的小鼠進行了一系列認知和行為分析。此外，我們還決定對另一組20個月大的小鼠進行評估，這些小鼠經口灌胃給予NMN（300mg/kg/天）約3周。許多研究（包括我們的研究）表明，補充NMN可以避免老年人NAMPT表達降低引起的NAD+減少老鼠。真的，我們證實NMN給藥能夠顯著增加老年小鼠海馬NAD+水平（補充圖1）。6 6

首先對磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）處理的年輕小鼠、PBS處理的老年小鼠和NMN處理的老年小鼠組進行1小時運動活動試驗，然後進行一系列感覺運動測量。對1小時運動活動試驗的總步行量（全身運動）資料進行的重複測量方差分析（rmANOVA）顯示，儘管存在顯著的逐時互動作用，但無顯著的群體效應（圖1b；F（10，185）=4。31，p=0。0001）。相互作用效應的很大一部分是由於PBS處理的年輕組和PBS處理的老年組在前10min時間點的差異（p=0。001），以及PBS處理的年輕組和NMN處理的老年組在相同時間間隔的差異（p=

0。002）。 對來自感覺運動電池的資料的分析表明，年輕小鼠通常比老組表現更好，特別是在平臺、杆和60°傾斜螢幕試驗上（補充圖2）。

隨後在Morris水迷宮（MWM）中評估小鼠的空間學習和記憶能力。線索試驗（可見平臺；可變位置）的逃逸路徑長度資料產生了顯著的組間效應（圖1c；F（2，37）=3。86，p=0。030）和顯著的組間互動作用

（F（6111）=2。45，p=0。038）。這種相互作用效應主要是由於PBS治療組和NMN治療組在第一次治療期間的路徑長度比年輕組顯著增加（分別p=0。017和p=0。002）。儘管這兩個老組在最初接觸MWM期間表現出受損，但在提示試驗結束時，這三個組的表現都處於可比水平。在提示試驗期間，發現游泳速度存在群體效應（圖1d；F（2，37）=11。81，p=0。0001）。在整個訓練過程中，在PBS組和NMN處理組中，年輕小鼠的平均游泳速度顯著快於老年小鼠（分別為p

對place試驗（隱藏平臺、單一位置；測試空間學習）的逃逸路徑長度資料的分析表明，不存在涉及組變數的顯著主效應或互動效應，表明三個組的獲得水平相當（圖1e）。療程的顯著影響（F（4，68）=21。69，p

完成MWM測試後，對小鼠進行條件性恐懼評估，以評估非空間巴甫洛夫條件反射能力。對第1天測得的基線冷凍水平的分析（圖2a）表明，組間效應不顯著，但組間時間互動作用顯著（F（2，37）=3。95，p=0。028）。三組小鼠在第1分鐘的冷凍水平相當，PBS處理組和NMN處理組在第2分鐘的冷凍水平高於PBS處理組（p=0。029和p=0。032）。這些

治療過的老老鼠）

根據Bonferroni校正（p

為了幫助解釋條件性恐懼測試中觀察到的表現差異，隨後對各組小鼠進行了足部電擊敏感性評估。雖然在退縮和發聲方面發現了不顯著的群體效應，但在逃逸行為方面發現了顯著的群體效應（圖2d；單因素方差分析，F（2，37）=8。48，p=0。0009）。成對比較的結果顯示，在PBS處理的老年小鼠中，與在PBS處理的年輕小鼠中觀察到的相比，休克引起的逃逸行為水平顯著降低（p=0。0002）。重要的是，與PBS處理的老年小鼠相比，NMN處理的老年小鼠需要更高水平的休克來誘導逃逸反應（p=0。020）。發聲也有類似的趨勢。這些結果表明，老年小鼠存在高度的致敏性，這反映了感覺加工和情緒（恐懼和/或焦慮）的改變。值得注意的是，儘管在第1天的初始基線期間，各組之間沒有觀察到冷凍水平的差異，但與幼鼠相比，在第3天的改變背景基線期間，每個老年組的冷凍水平都顯著高於幼鼠。這表明，在第2天的情境恐懼測試中觀察到的與年齡相關的差異不是由於條件反射/保持力的差異，而是由於兩個老年組暴露於足部電擊後對一般實驗程式的敏感程度提高。因此，我們建議使用認知過敏症這個術語來描述感覺加工和情緒性的年齡相關變化，並且這些變化可以透過補充NMN在老年小鼠中得到部分改善。

CA1特異性Nampt基因敲除重演了條件性恐懼反應中的年齡相關性超敏反應

以前的研究表明，透過FK866（一種有效的Nampt抑制劑）抑制Nampt的酶活性，或透過小干擾RNA敲除Nampt，靶向Nampt可以顯著降低細胞內NAD+的含量。鑑於在衰老過程中海馬中Nampt的表達和NAD+的含量都會降低，我們假設透過降低Nampt表達降低海馬NAD+水平可以重現在老年小鼠中觀察到的認知表型。我們還假設NAD+水平的區域特異性降低可能很重要，因為CaMKIIαNampt−小鼠的認知表型與野生型老年小鼠的認知表型非常不同。17，21 22

為了解決這些假設，我們決定建立一種特殊的Nampt基因敲除小鼠，因為CA1區最容易受到應激和其他神經退行性疾病的影響變化。弗洛茲將攜帶Cre重組酶和綠色熒光蛋白（GFP）基因（Cre-GFP）的腺相關病毒立體定向注射到3個月齡的Nampt小鼠體內GFP基因單獨進入海馬CA1區。注射的Cre-GFP病毒僅限於背側CA1區，僅在CA1區，而在CA3區和齒狀回（DG）區，顯示約60%的Nampt表達下調（圖3a）。在注射後4周，對這些CA1特異性Nampt敲除（CA1Nampt KD）和GFP病毒注射對照（GFP CON）小鼠進行相同的行為測試。兩組的一般步行活動沒有差異，隨著時間的推移，每一組的活動水平都有所下降，反映出對新環境的習慣（圖3b）。CA1Nampt-KD和GFP-CON小鼠在感覺運動測試中的表現也相似（資料未顯示）。此外，在MWM測試期間，兩組線上索、地點或探針（圖3c、d）試驗中沒有觀察到顯著的效能差異。23–25

在條件性恐懼程式的第1天，在基線期間觀察到CA1Nampt-KD和GFP-CON小鼠之間相似的冷凍水平，儘管CA1Nampt-KD小鼠在緊張性休克訓練期間確實表現出顯著的冷凍水平增加（圖3e；組效應：F（1，11）=14。33，p=0。003），成對比較顯示，各組在第3分鐘（p=0。008）和第4分鐘（p=0。005）之間存在顯著差異（根據Bonferroni校正：p

為了評估這種認知超敏反應是否可以透過敲除海馬其他區域的Nampt來觀察，我們還建立了DG特異性Nampt敲除小鼠。Nampt敲除效率約為40%（圖4a）。這些DG特異性Nampt敲除小鼠在情境恐懼條件反射試驗中沒有表現出認知超敏反應（圖4b-d）。這些結果表明，CA1在老年小鼠年齡相關的認知超敏反應中起重要作用。

Cask在老年海馬的表達對NAD+敏感並減少

為了尋找對海馬NAD+水平降低有反應的潛在候選基因，我們首先用濃度為10 nM和100 nM的FK866處理原代海馬神經元48小時。在濃度為10 nM和100 nM的FK866中，細胞NAD+水平分別降低60%和80%（圖5a）。然而，在用100 nM FK866處理48小時後，細胞活力僅略有下降（圖5b）。因此，我們使用100 nM FK866處理48小時的原代海馬神經元進行微陣列分析。在對細胞NAD+減少有反應的基因中，我們發現了一個名為鈣/鈣調素依賴性絲氨酸蛋白激酶（Cask）的基因。據報道，Cask與X連鎖精神發育遲滯和自閉症有關混亂。木桶是一種多域支架蛋白，據報道可介導攜帶N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）亞單位的囊泡的順行轉運，特別是GluN1和GluN2B，在神經元。木桶原代海馬神經元中的表達在FK866處理下降低，但在FK866存在下新增100μM NMN恢復（圖5c）。在整個海馬離體培養中，FK866也證實了Cask表達的減少（圖5d）。26 27，28 29

與我們發現的海馬NAD+水平隨著年齡的增長而降低（圖1a）相一致，我們發現在2到19個月大的時候，海馬Cask的表達也顯著降低了約30%（圖5e）。我們能夠證實海馬中Nampt的表達也隨著年齡的增長而減少（圖5e）。值得注意的是，在老年小鼠中補充NMN能夠

特異性地將Cask表達增加約2倍，而其他基因的表達，包括NMDAR亞單位和囊泡轉運亞單位，在對NMN的反應中沒有顯示出顯著的變化（圖5f）。因此，Cask的表達是以NAD+依賴的方式調節的，其與年齡相關的減少可以透過體內補充NMN來恢復。

SIRT1調節NAD反應的Cask表達+

NAD+依賴性介質的一個主要組是sirtuin家庭。在特別是SIRT1在調節海馬功能，包括長時程增強和學習記憶等方面起著重要作用記憶。到檢測Cask的NAD+依賴調節是否由任何sirtuin家族成員介導，尤其是SIRT1，我們透過構建由Cask基因的~2kb上游基因組片段驅動的熒光素酶報告子，採用瞬時轉染分析（圖6a）。我們使用HEK293細胞進行檢測，因為它們的SIRT1蛋白的內源性表達非常低。我們發現當Sirt1微基因共轉染+（圖6b）時，Cask啟動子對NAD+水平的變化有反應。當FK866抑制NAMPT介導的NAD+生物合成時，Cask啟動子活性降低，而在FK866存在下加入NMN則顯著恢復其活性。當未引入SIRT1時，未觀察到Cask啟動子的NAD+依賴性（圖6c）。此外，在存在SIRT1的情況下，Cask啟動子活性被EX527顯著抑制，EX527是一種有效的SIRT1抑制劑（圖6b，c），支援Cask啟動子NAD+依賴調節的SIRT1依賴性。總之，Cask的表達似乎是以NAD+/SIRT1依賴的方式調節的，而且年齡相關的NAD+減少很可能導致Cask表達的下調，這可能導致海馬認知功能的年齡相關變化。11 12，13

討論

在我們目前的研究中，我們發現年長的老鼠在暴露於某些令人厭惡的環境刺激後產生了認知超敏反應，這可能反映了情緒（恐懼和/或焦慮）和感覺加工的年齡相關改變。這種超敏反應表現為在聲調休克訓練、情境恐懼和聽覺線索測試過程中，冰凍程度顯著增加。年齡相關的休克敏感性差異可能在老年小鼠在第1天的音調休克訓練中表現出的這種高冷凍反應中起作用，這可能會增加它們足部休克的顯著性，並導致條件反射的增強，導致在情境恐懼和聽覺線索測試中冰凍程度大大增加。然而，在第3天測量的改變的背景基線期間，增加的凍結水平表明，這些凍結對背景和聽覺線索的差異並不代表真正的條件反射/保留效應。更確切地說，在暴露於足部電擊後的條件性恐懼過程中，老老鼠對一般環境變化變得超敏感。有趣的是，向老年小鼠補充NMN能夠減輕與年齡相關的認知超敏反應和與年齡相關的休克敏感性增加，這增加了NMN補充程式的修改（例如。，延長治療時間）可能會導致更大的積極影響有關假定的情緒成分的年齡相關的過敏以及。

上述與年齡相關的認知超敏反應可能是由於海馬NAD+下降所致，因為短期補充NMN可以改善老年小鼠休克敏感性閾值的降低。此外，CA1特異性而非DG特異性的Nampt消融再現了老年小鼠的認知超敏反應，為Nampt介導的NAD+生物合成在海馬認知功能中的作用提供了支援。我們還發現Cask的表達以NAD+/SIRT1依賴的方式被調節，而海馬Cask的表達在老年小鼠中被特異性下調。在其產物參與神經元囊泡轉運和突觸功能的基因中，只有Cask在老年海馬對短期補充NMN的反應中顯示出顯著的上調。這些結果表明，年齡相關的NAMPT介導的NAD+生物合成的減少有助於老年期海馬依賴性認知功能的改變。

已經證實，在治療過程中，多個外周組織以及大腦中的NAD+水平顯著降低衰老。這個NAD+的減少至少部分是由於Nampt表達的減少。例如，我們以前和現在的研究已經表明，NAD+和Nampt水平隨著年齡的增長而降低海馬。有趣的是成人神經幹/祖細胞（NSPC）中Nampt的消融再現了它們在衰老過程中的功能缺陷，NMN可顯著挽救衰老過程中NSPC庫的減少補充。因此衰老過程中NAMPT和NAD+的丟失可引起小鼠多種認知和行為方式的顯著改變。事實上，CaMKIIαNampt−/−小鼠在前腦興奮性神經元中特別缺乏Nampt，表現出多種行為和認知損傷，包括多動症、記憶缺陷和神經功能減退焦慮。儘管如此這些小鼠不能重現在老年小鼠中檢測到的認知超敏反應。相反，CA1特異性Nampt敲除小鼠能夠重現老年小鼠的這種特殊認知表型。與其他海馬區相比，年齡相關的NAD+減少是否在CA1區更大程度上發生仍然沒有答案。在衰老過程中，檢測海馬不同區域NAD+水平具有重要意義。6 17 17 22

為什麼老老鼠會出現認知超敏表型？我們已經確定Cask是海馬中與年齡相關的NAD+減少的潛在下游靶點。Cask的表達對海馬神經元和體內NAD+變化敏感。海馬Cask表達在衰老過程中顯著下調，補充NMN可以改善這種情況。Cask是一種多結構域的支架蛋白，在細胞連線和細胞凋亡中起重要作用突觸。特別是據報道，木桶與NMDAR的GluN2B亞基相互作用，並在另一種分泌途徑中工作，以轉運含GluN2B的蛋白質小泡。木桶30 29

平均值±SE

缺乏導致NMDARs在第二階段減少約40%突觸。另外，木桶可能移位到細胞核並與T-腦-1（TBR1）相互作用，腦特異性T盒轉錄因子。木桶–TBR1相互作用對增加TBR1的轉錄活性和上調Grin2b（GluN2B）很重要表示式。GluN2B它確實是一個亞單位，其信使RNA（mRNA）和蛋白質表達在轉錄過程中顯著減少衰老。因此， 年齡相關的Cask表達減少可能透過影響其表達水平和/或其向突觸的轉運而損害含有GluN2B的NMDARs的功能。考慮到Cask基因突變的個體會發展為智力低下和自閉症譜系障礙，可以想象的是，年齡相關的Cask表達減少可能透過含有GluN2b的NMDAR的功能障礙導致廣泛的認知障礙。需要進一步研究CA1特異性敲除Cask或Grin2b是否可以重現在老年小鼠中觀察到的認知超敏反應。29 30–33 32，34–36 37–40 27，28

有趣的是，Cask的表達似乎受到SIRT1依賴性的調控。因為EX527消除了Cask啟動子的SIRT1依賴性啟用，SIRT1的NAD+依賴性脫乙醯酶活性是這種轉錄調控所必需的。然而，SIRT1調控Cask啟動子的靶點尚不清楚。我們試圖透過染色質免疫沉澱來觀察SIRT1是否存在於Cask啟動子上。然而，到目前為止，我們還沒有在Cask啟動子上檢測到SIRT1的存在（資料未顯示）。因此，SIRT1脫乙醯化關鍵轉錄因子並激活其對Cask啟動子的轉錄活性是可能的。

綜上所述，我們提出以下模型（圖6d）。在正常老化過程中，海馬神經元，尤其是CA1神經元的NAMPT和NAD+水平顯著下降。這種NAD減少導致SIRT1活性降低，導致老年海馬Cask表達減少。這種Cask的減少可能會減少GluN2B在突觸的定位，從而導致海馬認知和行為功能在衰老過程中的改變。重要的是，NMN是NAD+的關鍵中間體，也是NAMPT反應的主要產物，可以改善我們在老年小鼠中觀察到的認知超敏反應的某些方面。如果在老年人中也觀察到這種認知超敏反應，服用NMN可以改善他們的健康狀況，並可能提高他們的生活質量。

總之，我們的研究表明年齡相關的認知和行為功能的改變是由老年小鼠海馬NAMPT介導的NAD+生物合成減少引起的，特別是在CA1區。我們的研究還表明，即使在短期內，補充NMN也能夠減輕年齡相關的對某些厭惡性刺激和其他相關行為的感覺加工的改變。雖然進一步的詳細分析是必要的，但我們的發現提供了關鍵的見解，即衰老如何影響認知和行為功能，以及如何預防或治療這些損傷以提高我們以後的生活質量。

圖5老化過程中海馬Cask表達對NAD+敏感並減少。a用DMSO或FK866在10nm和100nm處處理48h的原代海馬神經元的細胞NAD+水平（n=12；**p

圖6以NAD+/SIRT1依賴方式調節Cask啟動子活性。Cask基因的~2kb上游區域如圖所示。有兩個潛在的Oct-1結合位點。b、 c在與報告構建物和Sirt1微基因（b）或其僅啟動子控制載體（c）共轉染的HEK293細胞中，用FK866（100 nM）、FK866（100 nM）加NMN（100μM）、NMN（100μM）或EX527（10μM）處理，測量由~2 kb Cask啟動子片段驅動的相對熒光素酶活性。熒光素酶活性與DMSO處理的對照細胞的熒光素酶活性標準化（n=9；*p

+ 老年人年齡相關NAD/SIRT1介導的Cask表達減少與認知超敏反應關係的模型

致謝

感謝Steven Mennerick、Joseph Dougherty、Michael Bruchas和Imai實驗室成員對本研究提出的批評意見和建議，感謝Akiko Satoh和她的實驗室成員測量NMN給藥的老年小鼠海馬NAD+水平，以及華盛頓大學醫學院神經疾病希望中心病毒載體中心和動物外科中心以及動物行為中心的工作人員。這項工作主要得到了國家老齡研究所（AG037457，AG047902）、美國老齡研究聯合會和S。I。田中基金的資助，也得到了日本東京老齡化和長壽機制闡明和控制專案的部分支援。

以上內容由康特生物科技有限公司為研發康特NMN所提供的內部資料，僅供學習參考