前言
2020年7月
安徽農業大學高智謀教授課題組
在Journal of Agricultural and Food Chemistry期刊發表的題為 “Proteomics reveals the mechanism underlying the inhibition of Phytophthora sojae by propyl gallate ”的研究成果，透過
蛋白質組學、CRISPR / Cas9基因編輯技術和代謝組學研究方法，
探究了棓丙酯抑制大豆疫黴菌機理，為大豆疫黴菌的防治提供了理論依據。
中文標題：蛋白質組學揭示棓丙酯抑制大豆疫黴菌的機制
研究物件：大豆疫黴
發表期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
影響因子：4。192
發表時間：2020年7月
運用生物技術：
TMT標記定量蛋白質組學、GC-MS代謝組學
研究背景
大豆作為重要的經濟作物，其主要病害的生物防治研究引起了研究人員的關注。大豆疫黴是一種嚴重的土壤致病菌，對其採取的主要控制措施包括誘導大豆抗性基因、使用殺真菌劑以及科學合理的種植管理。而不合理使用殺真菌劑會導致病原體產生抗藥性，從而嚴重威脅食品生產過程的安全性。
據報道，大豆疫黴對甲霜靈、氟苯丙氨酸和苯甲醯等殺菌劑具有抗藥性。因此篩選新的控制替代品非常重要。本文作者在初步研究中發現棓丙酯對大豆疫黴菌具有相當大的抑制作用，並且可以有效預防和治癒大豆疾病，但其潛在機制尚不清楚。為了探索棓丙酯對大豆疫黴菌的抑制機制，文章使用TMT蛋白質組學分析了棓丙酯預處理大豆前後的蛋白質譜差異。
研究思路
研究方法
1.實驗材料
表型實驗：
處理組中將棓丙酯水溶液新增到10％固體V8培養基中，最終培養基中棓丙酯的濃度為1和2 mmol/L。沒有棓丙酯水溶液的培養基作為對照。在這些培養基中接種大豆疫黴菌，五天後觀察到棓丙酯對大豆疫黴的抑制作用。
組學實驗：
將棓丙酯的水溶液新增到20 mL的V8液體培養基中，使棓丙酯在培養基中的終濃度為1 mmol/L，在每種培養基中分別放入六個大豆疫黴菌培養皿。每種處理重複三次，每組重複十次。將培養皿置於25℃避光孵育三天後收穫菌絲；除去瓊脂塊並用液氮冷凍以製備用於提取的蛋白質。
2.蛋白質組學分析
（1）TMT標記定量蛋白組學分析
對照組和棓丙酯處理組（1 mmol/L）的大豆疫黴菌，提取蛋白後進行TMT標記定量蛋白組學分析，每組3次重複。
（2）PRM靶向定量蛋白組學
隨機選擇15種差異表達蛋白進行PRM靶向定量驗證
3. 功能驗證
基因敲除：
CRISPR / Cas9基因編輯用於敲除PsFACL和PsCPT
脂肪酸代謝組學研究：
菌落直徑為指標來評估脂肪酸代謝調控基因是否參與營養生長；感染斑直徑和相對生物量指數用以測定大豆疫黴菌的毒力；GC-MS代謝組學用於測量脂肪酸含量。
研究結果
1.棓丙酯抑制大豆疫黴菌的生長和感染
與對照組相比，經棓丙酯處理的大豆疫黴菌在固體培養基中生長緩慢，且當棓丙酯濃度達到2mmol/L時大豆疫黴菌難以生長（圖1A）。為了獲得蛋白質組學的研究材料，作者採用液體培養基培養，使用1mmol/L的棓丙酯處理大豆疫黴菌得到的溼重顯著低於對照組（圖1B）。培養48小時後，棓丙酯處理組樣本顏色呈淡黃色（圖1C）。此外，使用2mmol / L 棓丙酯溶液處理分離的大豆葉片和盆栽大豆，可有效抑制大豆疫黴感染（圖1D和E）。
圖1 | 棓丙酯抑制大豆疫黴菌的生長和感染
（A）棓丙酯在固體V8培養基上抑制大豆疫黴菌的生長。
（B）在液體V8培養基和具有1mmol / L 棓丙酯的液體V8培養基中培養的生物質的溼重。
（C）液體培養基中的大豆疫黴菌的菌絲。
（D和E）離體葉片和完整植物中的毒力差異。
2.蛋白質組學質控和重複性評估
蛋白質電泳表明處理組和對照組均檢測到大多數蛋白質，並且基本上相同。在25-55 kDa範圍內具有一些表達量不同的蛋白質（圖2A）。PCA分析結果表明兩組間蛋白質表達譜可顯著區分（圖2B）。相對標準偏差的統計分析顯示，對照組中三個生物學重複的相對標準偏差
圖2 | 大豆疫黴菌樣本的SDS-PAGE和PCA分析
（A）SDS-PAGE。
（B）PCA分析
（C）相對標準偏差的統計分析
3.蛋白質組學GO富集分析
GO富集分析結果見圖3中。上調的差異蛋白富集了“核糖核蛋白複合物”，“細胞核心糖核蛋白複合物”和“核糖體”等細胞成分的條目（圖3A）。下調的差異蛋白富集在“細胞外區域”和“細胞膜”的細胞成分條目中，以及“轉運蛋白活性“、”跨膜轉運蛋白活性”和“底物特異性轉運蛋白活性”等分子功能條目。這些結果說明在棓丙酯處理下，大豆疫黴菌細胞膜養分轉運減少（圖3B），這也表明碳水化合物的利用可能受到不利影響。
圖3 |差異表達蛋白的GO富集分析
（A）上調差異表達蛋白
（B）下調差異表達蛋白
4.蛋白質組學KEGG富集分析
KEGG分析顯示（圖4），上調的差異蛋白富集了“核糖體”、“糖酵解/糖異生”和“次級代謝產物的生物合成”的通路。下調的蛋白質主要富集在“酪氨酸代謝”、“苯丙氨酸代謝”，“泛醌和其他萜類醌醌的生物合成”、“次級代謝產物的生物合成”、“脂肪酸降解”、“澱粉和蔗糖代謝”、“糖酵解/糖異生”、“氰基氨基酸代謝”等代謝通路。
圖4 | 差異表達蛋白的KEGG富集分析
（A）上調差異表達蛋白
（B）下調差異表達蛋白
5.PRM靶向驗證
作者選取了15種蛋白質進行PRM靶向蛋白質組驗證，併成功對其中的14種蛋白質進行了PRM定量。結果表明PRM靶向定量結果與TMT定量結果相一致（圖5）。
圖5 | 差異表達蛋白的PRM驗證結果
6.PsFACL和PsCPT參與了大豆疫黴菌的生長
為了確認棓丙酯是否透過抑制PsFACL和PsCPT的表達來抑制大豆疫黴，作者敲除了PsFACL和PsCPT的相關候選基因。在進行gDNA PCR和測序篩選後，篩選了七個獨立的敲除轉化子突變體，並且隨機選擇了FACLT10，FACLT13，FACLT17，CPTT1，CPTT3和CPTT7作為後續測試材料。
野生型（WT）和敲除失敗的轉化子（CKFACL和CKCPT）轉移到空載體中並用作對照。將它們接種在10％V8培養基中並觀察其生長（圖6）。結果顯示轉化子FACLT10，FACLT13和FACLT17的生長速度相對較低，菌落直徑明顯小於WT和CKFACL（P
圖6 |不同大豆疫黴菌菌株的生長率差異
（A）對照和轉化體的菌落形態
（B）對照和轉化體的菌落直徑統計分析
7. PsFACL和PsCPT參與了大豆疫黴菌的致病性調控
在接種不同菌株48小時後進行的脫色實驗（decolorization experiments）中，大豆葉片上由轉化體FACLT10，FACLT13，FACLT17，CPTT1，CPTT3和CPTT7引起的病變直徑明顯小於CKFACL和CKCPT轉化子及野生型引起的病變直徑（圖7），表明PsFACL和PsCPT基因參與了大豆疫黴的致病性調節，並且該特性與其調節大豆疫黴的生長能力有關。
圖7 | 大豆疫黴菌的毒力差異
（A）接種48 h後，由對照和轉化子引起的病斑脫色
（B）對照和轉化子病灶直徑的顯著性分析
8. PsFACL和PsCPT參與脂肪酸代謝的調節
候選基因PsFACL和PsCPT最有可能參與了脂肪酸代謝；Yousef等人［參考文獻1］發現14C（14：0），16C（16：0），16C飽和（16：1ω7）和18C不飽和脂肪酸（18：1ω9和18：2ω6）是大豆疫黴的主要脂肪酸，它們佔脂肪酸總含量的78％以上。作者在文章中測試了主要脂肪酸含量（圖8）。結果顯示，與野生型和CKFACL型相比，FACLT10、FACLT13和FACLT17中的六種脂肪酸的含量均有不同程度的降低。
圖8 | 不同菌株的大豆疫黴菌中六種脂肪酸的含量
研究結論
作者發現棓丙酯可以有效抑制大豆疫黴菌的生長和感染，為了探究相關機制，作者透過TMT蛋白質組學分析了棓丙酯處理前後大豆疫黴菌的蛋白質表達譜。結果在處理組中發現了75種上調蛋白和210種下調蛋白，差異蛋白的通路富集分析主要集中在糖酵解、三羧酸迴圈、脂肪酸代謝和次生代謝產物通路。在這些差異蛋白中，包括PHYSODRAFT_522340和PHYSODRAFT_344464編碼的兩個密切相關的未表徵蛋白，作者對其以PsFACL和PsCPT命名。CRISPR / Cas9敲除技術表明PsFACL和PsCPT參與了大豆疫黴菌的生長和致病性調節。
另外GC-MS代謝組學的結果表明，野生型（WT）和CRISPR / Cas9敲除轉化體之間的脂肪酸水平存在差異。敲除PsFACL和PsCPT分別限制了長鏈脂肪酸的合成和β-氧化，這些結果提示PsFACL和PsCPT也參與脂肪酸代謝的調節。本文結果有助於理解棓丙酯抑制大豆疫黴菌生長的機制。
小鹿推薦
大豆疫黴菌是一種嚴重的土壤傳播病原體，而其對常用殺菌劑的抗藥性使得篩選新的替代品成為重要的研究方向。棓丙酯作為食品抗氧化劑具有良好的安全性，且本文作者發現棓丙酯可有效抑制大豆疫黴菌的生長和感染。作者使用蛋白質組學探索相關機制，對選出的差異蛋白PsFACL和PsCPT使用CRISPR / Cas9基因敲除技術進一步深入探索其對大豆疫黴菌生長和致病性的調控，發現並驗證了其參與脂肪酸代謝的機制。作者的實驗思路結合文獻調研推導機制的過程值得借鑑和參考。
部分參考文獻：
［1］ Yousef， L。 F。； Wojno， M。； Dick， W。 A。； Dick， R。 P。 Lipid profiling of the soybean pathogen Phytophthora sojae using Fatty Acid Methyl Esters （FAMEs）。 Fungal。 Biol。 2012， 116（5）， 613-619。
［2］ Dong Liu et al。 Proteomics Reveals the Mechanism Underlying the Inhibition of Phytophthora sojae by Propyl Gallate。 J Agric Food Chem。 2020 Jul 23。
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文章來源於鹿明生物